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細胞NADPH氧化酶活性光度法定量檢測試劑盒
點擊次數(shù)：583 發(fā)布時間：2015-1-28
YIJI細胞NADPH氧化酶活性光度法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）
主要用途
YIJI細胞NADPH氧化酶活性光度法定量檢測試劑是一種旨在使用特異性抑制劑，通過反應(yīng)系統(tǒng)測定樣品中還原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化后峰值的降低，即采用光度法測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種細胞樣品（動物或人體）還原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH氧化酶）的特異活性檢測。用于免疫、血液研究、蛋白組學、病理生理學等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測敏感。
技術(shù)背景
NADPH氧化酶，通常稱為還原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase；NADPH oxidase；EC1.6.3.1）或還原型輔酶II氧化酶，是機體防御機制中的重要元素。NADPH氧化酶由6個亞體構(gòu)成：Rho GTP酶（Rho guanosine triphosphatase）和5個phox（吞噬細胞氧化酶；phagocytic oxidase）。其中主要包含細胞膜嵌合蛋白質(zhì)分子（gp91phox、p22phox、flavocytochrome b558等），以及位在細胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)分子（p47phox、p67phox、p40phox、Rac1、Rac2等）。其zui特征性的酶活性是超氧化物歧化酶敏感的還原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶。細胞膜上的NADPH氧化酶被激活，將還原型輔酶Ⅱ（NADPH）轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸洼o酶Ⅱ（NADP），氧分子則獲得電子形成超氧陰離子O2-，由O2-又可生成H2O2和OH－。其超氧陰離子產(chǎn)物具有殺死微生物的功能。NADPH氧化酶異常將導(dǎo)致慢性肉芽腫病（Chronic Granulomatous Disease；CGD）。基于底物還原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），在特異性抑制劑聯(lián)苯基三價碘（diphenyleneiodonium；DPI）的存在下，受到NADPH氧化酶的催化作用，轉(zhuǎn)化為氧化型*腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP），產(chǎn)生吸光峰值的變化，通過分光光度儀（340nm波長）檢測，來測定NADPH氧化酶的特異活性。其反應(yīng)方式為：
產(chǎn)品內(nèi)容
YIJI清理液（Reagent A） 毫升
YIJI裂解液（Reagent B） 毫升
YIJI緩沖液（Reagent C） 毫升
YIJI反應(yīng)液（Reagent D） 毫升
YIJI陰性液（Reagent E） 毫升
YIJI底物液（Reagent F） 微升
YIJI專性液（Reagent G） 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存YIJI清理液（Reagent A）和YIJI陰性液（Reagent E）在4℃冰箱里，其余的保存在在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；YIJI反應(yīng)液（Reagent D）和YIJI底物液（Reagent F），避免光照，有效保證6月
用戶自備
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器
細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離
4℃（微型）臺式離心機：用于樣品處理
恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于反應(yīng)物孵育
比色皿：用于光度測定的容器
分光光度儀：用于光度分析
實驗步驟
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；YIJI反應(yīng)液（Reagent D）和YIJI底物液（Reagent F）注意避光。然后進行下列操作。
一、樣品準備
- 準備好25cm2細胞培養(yǎng)瓶或60mm細胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細胞（1至5 X 106細胞）
- 小心加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
- 小心抽去清理液
- 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用*消化）
- 加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），混勻細胞
- 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
- 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
- 小心抽去上清液
- 加入xx微升YIJI裂解液（Reagent B），充分混勻
- 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
- 強力渦旋震蕩15秒
- 置于冰槽里孵育30分鐘
- 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
- 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－YJ30030.1）
- 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、測定準備
- 從-70℃取出待測樣品（例如細胞裂解懸液樣品等），置于冰槽里
- 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零
- YIJI緩沖液（Reagent C）室溫預(yù)熱
- 背景對照測定
- 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent D）
- 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
- 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
- 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent E）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
- 即刻放入分光光度儀檢測，此為背景空對照：（340波長讀數(shù)）0分鐘－（340讀數(shù)）5分鐘
- 樣品總活性測定
- 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent D）
- 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
- 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
- 加入100微升待測樣品（注意：50至100微克細胞裂解懸液蛋白；樣品須溶解；參見注意事項5、11和12）
- 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
- 即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù)：（340波長讀數(shù)）0分鐘－（340讀數(shù)）5分鐘
- 樣品非特異活性測定
- 準備1個1.5毫升離心管
- 加入xx微升YIJI專性液（Reagent G）
- 加入100微升待測樣品（注意：50至100微克細胞裂解懸液蛋白；樣品須溶解；參見注意事項5、11和12）
- 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置5分鐘
- 放進冰槽里備用
- 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent D）
- 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
- 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘
- 加入上述冰槽里的xx微升含有YIJI專性液（Reagent G）和待測樣品的溶液
- 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）
- 即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品非特異活性讀數(shù)：（340波長讀數(shù)）0分鐘－（340讀數(shù)）5分鐘
- 計算樣品活性
1）樣品總活性和非特異活性
2）樣品特異活性
注意事項
- 本產(chǎn)品為21次（10個樣本）操作，包括1次背景對照測定
- 操作時，須戴手套
- YIJI反應(yīng)液（Reagent D）和YIJI底物液（Reagent F）注意避光
- 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次
- 樣品檢測前，須溶解和澄清
- 加樣后3秒內(nèi)進行光度測定
- 光度測定后，比色皿須清洗*
- 樣品0秒讀數(shù)通常和背景空對照0秒讀數(shù)一致
- 反應(yīng)測定值由高到低變化；測定持續(xù)5分鐘
- 測定值由高到低變化，表明有酶活性
- 建議待測樣本蛋白濃度為50至100微克/100微升；如果樣本酶活性過低，則可以增加樣本量（本公司提供YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒YJ30030.1）
- 如果使用純化目標蛋白，則蛋白濃度為1至5微克/100微升；如果使用純化膜蛋白，則蛋白濃度為10微克/100微升
- 樣品實際活性是指聯(lián)苯基三價碘（diphenyleneiodonium；DPI）敏感的還原型*腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，去除其它干擾因素
- NADPH氧化酶活性單位濃度定義：在30℃室溫下，pH 7.0的情況下，每單位酶在單位時間內(nèi)（每分鐘）氧化1微摩爾的還原型輔酶Ⅱ（NADPH）
- 本公司提供系列氧化酶類分析技術(shù)產(chǎn)品
質(zhì)量標準
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
- 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測準確