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反義RNA
點擊次數(shù)：503 發(fā)布時間：2013-8-7
反義RNA-定義
反義RNA是指與mRNA互補的RNA分子, 也包括與其它RNA互補的RNA分子。由于核糖體不能翻譯雙鏈的RNA，所以反義RNA與mRNA特異性的互補結合, 即抑制了該mRNA的翻譯。通過控制mRNA的翻譯是原核生物基因表達調(diào)控的一種方式，zui早是在E.coli 的產(chǎn)腸桿菌素的Col E1質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的,許多實驗證明在真核生物中也存在。近幾年來通過人工合成的基因, 并將其導入細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成, 即能抑制某特定基因的表達,阻斷該基因的功能, 有助于了解該基因?qū)毎L和分化的作用。同時也暗示了該方法對腫瘤實施基因治療的可能性。
-來源
細胞中的來源有兩種途徑∶*是反向轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物，在多數(shù)情況下, 是特定靶基因互補鏈反向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物, 即產(chǎn)生mRNA和的DNA是同一區(qū)段的互補鏈。第二種來源是不同基因產(chǎn)物，如OMPF基因是大腸桿菌的膜蛋白基因，與透性有關，其反義基因MICFZE則為另一基因。
-分類 編輯本段回目錄
的分類和作用機制：下表總結了原核細胞內(nèi)天然存在的11種。這些按其作用機制可經(jīng)分為三大類。
調(diào)節(jié)水平 靶RNA 分類 功能 來源
轉(zhuǎn)錄后水平 micF RNA ompF mRNA 1A OmpF合成 染色體
oop RNA cⅡmRNA 1B 溶菌-溶源 噬菌體
sar RNA antmRNA 1A 溶菌-溶源 噬菌體
ouT RNA 轉(zhuǎn)位酶mRNA ⅠA 轉(zhuǎn)位作用 轉(zhuǎn)位子
finp RNA traJ mRNA ⅠA DNA轉(zhuǎn)位
sok RNA hok mRNA ⅠA 殺死作用
copA RNA repA mRNA Ⅱ 復制 質(zhì)粒
R1162RNA repⅠmRNA Ⅱ 復制
pT181RNA repC mRNA Ⅱ 復制
轉(zhuǎn)錄水平 ticRNA CAP mRNA Ⅲ cAMP結合蛋白 染色體
復制前水平 RNAⅠ RNAⅡ Ⅲ DNA復制 質(zhì)粒
Ⅰ類:這類直接作用于其靶mRNA的SD序列和/或編碼區(qū)，引起翻譯的直接抑制（ⅠA類）或與靶mRNA結合后引起該雙鏈RNA分子對RNA酶Ⅲ的敏感性增加，使其降解（ⅠB類）。Ⅱ類:這類與mRNA的SD序列的上游非編碼區(qū)結合，從而抑制靶mRNA的翻譯功能。其作用機制尚不*清楚，可能是與靶mRNA的上游序列結合后會引起核糖體結合位點區(qū)域的二級結構發(fā)生改變，因而阻止了核糖體的結合。Ⅲ類:這類可直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。
ticRNA（transcription inhibitory complementary RNA）是大腸桿菌中CAP蛋白（cAMP結合蛋白）的mRNA的。ticRNA的基因的啟動子可被cAMP-CAP復合物所激活，從CAP mRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點上游3個核苷酸處開始，以CAP mRNA的模板DNA鏈的互補鏈為模板，合成ticRNA。ticRNA具體長度不清楚，但是它是5'端一段正好和CAP mRNA的5'端有不*的互補，可以形成雙鏈的RNA雜交體。而在CAP mRNA上緊隨雜交區(qū)之后的是一段約長11bp的A，U豐富區(qū)。這樣的結構十分類似于ρ不依賴性的轉(zhuǎn)錄終止子的結構，從而CAP mRNA的轉(zhuǎn)錄剛剛開始不久后即迅速終止。從這個例子中我們可以看到CAP蛋白合成的自我調(diào)節(jié)作用。當CAP合成達一定量后，即可與cAMP結合成cAMP-CAP復合物。再激活ticRNA的啟動子轉(zhuǎn)錄出ticRNA，反過來抑制CAP-mRNA的合成。
-功能
在原核生物中具有多種功能，例如調(diào)控質(zhì)粒的復制及其接合轉(zhuǎn)移，抑制某些轉(zhuǎn)位因子的轉(zhuǎn)位，對某些噬菌體溶菌-溶源狀態(tài)的控制等。下文僅舉數(shù)例。
1.調(diào)控細菌基因的表達:對編碼CAP的基因的調(diào)控作用已如前述。這里再介紹一下micF RNA對ompF基因的表達的調(diào)控。ompF蛋白質(zhì)是大腸桿菌的外膜蛋白的主要成分這一。micF RNA是從另一基因（ompC基因）附近的DNA序列轉(zhuǎn)錄而來，和o-mpFn RNA的5'端有70%的序列互補，因此在體外micF RNA可以抑制ompF mRNA的翻譯。但是這種抑制作用在體內(nèi)是否重要尚有疑問，因為缺失micF基因的菌株其ompF蛋白的表達只受到輕微的影響。
2.噬菌體溶菌/溶源狀態(tài)的控制:也參與了λ和P22噬菌體的溶菌/溶源狀態(tài)的控制。P22噬菌體編碼一種抗阻遏蛋白Ant，它可以抑制許多λ樣噬菌體的阻遏蛋白與DNA的結合。這對于剛剛感染細胞的P22建立λ樣原噬菌體（prophage）是有益的。但是Ant必須在嚴格的控制下，否則Ant的過分表達必將阻止溶源狀態(tài)的建立，而成為溶菌性的噬菌體。Ant蛋白質(zhì)表達的控制是利用（sarRNA）能與ant mRNA的翻譯起源區(qū)互補結合，從而抑制ant mRNA翻譯成Ant蛋白。
在λ噬菌體中cⅡ蛋白控制著溶菌或溶源狀態(tài)的選擇。cⅡ蛋白可以激活λPre啟動子，該啟動子控制的基因是λ噬菌體整合作用所必須的，且同時能抑制λ噬菌體的復制。cⅡ蛋白的另一功能是延緩λ晚期基因的表達，其作用機制是cⅡ蛋白激活PaQ的啟動子，轉(zhuǎn)錄出PaQRNA。PaQRA是編碼Q蛋白的mRNA的。因此，PaQRNA能與QmRNA配對雜交而抑制其翻譯，而Q蛋白早已知道是晚期基因表達的激活蛋白。
cⅡ基因本身的表達還受到稱為oopRNA的的調(diào)控。oopRNA與cⅡ基因的3'端互補，但其具體作用機制尚不清楚。
3.IS10轉(zhuǎn)位作用的抑制:outRNA是一種，可以和IS10編碼的轉(zhuǎn)位酶mRNA（INRNA）5'端結合而抑制其翻譯，當細胞內(nèi)只有一個考貝IS10時，只能生成很少量的outRNA，故轉(zhuǎn)位酶仍可生成。但當IS10的考貝數(shù)增多時，outRNA愈來愈多，其控制作用亦明顯增強，所以稱為多考貝抑制現(xiàn)象。這種現(xiàn)象可以防止IS10的過量堆積引起的細胞損害。
-人工合成
既然在原核生物中對基因表達起著重要的調(diào)控作用，那末人工設計在天然狀態(tài)下不存在的來調(diào)節(jié)靶基因的表達，想必也是可能的。這已在不少實驗中得到證實。
1.由于目前對靶mRNA的SD序列的上游區(qū)的結構了解甚少，因此，在要設計Ⅱ類用于和靶mRNASD序列上游區(qū)結合，以期達到調(diào)節(jié)該mRNA翻譯的目的是比較困難的。
2.Ⅲ類是和mRNA的起始處結合而形成類似ρ-不依賴性的轉(zhuǎn)錄終止子而使轉(zhuǎn)錄水平上抑制靶基因的表達。因此，要設法在靶mRNA上找到一段連續(xù)的U序列，就可以設計出，與該U序列上游的mRNA鏈互補，以形成ρ-不依賴性終止子。理想的作用位點是在靶mRNA的5'端上游的非編碼區(qū)，以免受核糖體的影響。
3.只要靶基因的核苷酸順序已經(jīng)知道，就可以人工設計出Ⅰ類。有時還可設計同時具有Ⅰ類和Ⅲ類功能的。
我們還可以設計出天然存在的的來。這樣就可以拮抗原始對靶mRNA的抑制作用。而達到激活或加強某個靶基因的表達的目的。然而并不是所有的mRNA對其相應的Ⅰ類都敏感。例如，有的mRNA壽命很短，只有1-2分鐘，它們和結合的機會較少，因而就較不敏感。反之，另一些mRNA則很穩(wěn)定，壽命可達十多分種，則其對相應的的抑制作用就很敏感。此外，本身的穩(wěn)定性有很大的實際意義。顯然，穩(wěn)定的對靶mRNA的調(diào)節(jié)作用比不穩(wěn)定的要好。
使分子穩(wěn)定的方法如下：
[1]3'端帶有莖環(huán)結構或類似ρ-不依賴性終止子結構時，可以穩(wěn)定RNA分子。
[2]Gorski等還發(fā)現(xiàn)在T4噬菌體的基因32mRNA的5'端上游的莖環(huán)結構及其附近的序列亦可穩(wěn)定RNA分子。所以在設計基因時，將產(chǎn)生3'及5'端這種二級結構的序列克隆在基因的兩端。Hirashima等1986年發(fā)現(xiàn)，針對靶mRNA的SD序列和AUG區(qū)域的，要比單純對編碼區(qū)域的更為有效。1989年Hirashima又發(fā)現(xiàn)，針對SD序列和它的上游區(qū)域（但不包括AUG）的更為有效。在真核生物中，針對5'端非編碼區(qū)的更有效。但也有實驗表明針對*內(nèi)含子的也同樣有效。
現(xiàn)在設計基因是時應注意之點總結如下：
[1]長的并不一定比短的更為有效。
[2]在原核生物中針對SD序列及其附近區(qū)域的可能更有效。
[3]在真核生物中，對應于5'端非編碼區(qū)的可能比針對編碼區(qū)的更有效。
[4]盡量避免在分子中出現(xiàn)自我互補的二級結構。
[5]設計的分子中不應有AUG或開放讀框，否則該亦會與核糖體結合而影響其與靶mRNA的配對結合。
[6]進一步還可以將帶有ribozyme結構的RNA連在的3'端尾上，當與靶mRNA雜交后，即可利用其酶活性來降解靶mRNA。
此外，為了增強的作用，還可以采取一些額外措施，例如:[1]由于對靶mRNA的抑制作用有劑量依賴性，所以在構建基因時，要選擇強的、可以誘導的啟動子以增強本身的表達。[2]構建許多個基因串連在一起，以得到線性重復的多拷貝基因，對提高的表達也有利。[3]RNA酶Ⅲ可以降解RNA:RNA雜交體，所以在構建基因時，可將RNA酶Ⅲ的基因也同時轉(zhuǎn)化到靶細胞中并進行表達。這樣，當與靶mRNA結合后，RNA酶Ⅲ即可將其降解。這顯然有利于的抑制作用。
近年來，有關的研究進展迅速，已經(jīng)應用到抗病毒感染，研究癌基因的作用機制，探索*的可行途徑等方面。在今后一段時間內(nèi)，有關的研究肯定將會有更加迅速的進展和更廣闊的應用前景。
-技術
隨著分子生物學和遺傳工程的發(fā)展，基因治療應運而生，反義技術是其中一種，它的基礎是根據(jù)核酸雜交原理設計針對特定靶序列的反義核酸，從而抑制特定基因的表達，包括、反義DNA及核酶（Ribozyme），它們通過人工合成和生物合成獲得。
（一），根據(jù)的作用機制可將其分為3類：Ⅰ類直接作用于靶mRNA的S D序列和（或）部分編碼區(qū)，直接抑制翻譯，或與靶mRNA結合形成雙鏈RNA，從而易被RNA酶Ⅲ 降解；Ⅱ類與mRNA的非編碼區(qū)結合，引起mRNA構象變化，抑制翻譯；Ⅲ類則直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。
（二）反義DNA是指一段能與特定的DNA或RNA以堿基互補配對的方式結合，并阻止其轉(zhuǎn)錄和翻譯的短核酸片段，主要指反義寡核苷酸，因更具藥用價值而倍受重視。
（三）核酶（ribozyme）是具有酶活性的RNA，主要參加RNA的加工與成熟。天然核酶可分為四類：（1）異體催化剪切型，如RNaseP；（2）自體催化的剪切型，如植物類病毒、擬病毒和衛(wèi)星RNA；（3）*組內(nèi)含子自我剪接型，如四膜蟲大核26SrRNA；（4）第二組內(nèi)含子自我剪接型。利用反義技術研制的藥物稱反義藥物。反義藥物作用于產(chǎn)生蛋白的基因，因此可廣泛應用于多種疾病的治療，如傳染病、炎癥、心血管疾病及腫瘤等。與傳統(tǒng)藥物比較反義藥物更具選擇性及效率，因此也更低毒?；谏鲜鎏攸c反義藥物已成為藥物研究和開發(fā)的熱點。而且反義技術還可以應用于生物科學的基礎研究。