我們在解凍細胞時常常會遇到問題是解凍結束后，幾乎所有的細胞都死了。那么問題出在那里呢？細胞解凍時需要注意哪些問題？
其實細胞解凍時細胞死亡的主要原因有兩個：一是由于細胞融化方式有問題。二是由于細胞在高速離心時被剪切。 

    針對以上原因，細胞解凍時可以嘗試加入溫熱的培養(yǎng)基，讓它們靜置幾個小時到過夜，然后洗掉含有 DMSO 的培養(yǎng)基，并用普通培養(yǎng)基加血清喂養(yǎng)（增加血清濃度至10% 甚至 20% 一段時間）。不過 DMSO 是有毒的，所以在顯微鏡下看到細胞已經(jīng)沉淀后，請立即更換培養(yǎng)基。
如果 細胞解凍后將 DMSO 留在培養(yǎng)基中，那么低濃度的 dmso 對細胞的毒害程度是小的，當我們在 5-10 ml 培養(yǎng)基中稀釋少量細胞懸液，它會進一步稀釋 dmso。所以基本上可以排除在解凍初期DMSO對細胞的影響。

  實踐證明，如果細胞離心時，離心機速度超過1500rpm 或離心時間過長，均會對細胞產(chǎn)生不同程度的傷害。所以剛解凍的細胞離心時，離心機的速度，控制在900-1000 rpm ，4-5 分鐘就足夠了。
另外， 保存細胞的方法也很重要。如果您將細胞直接冷凍在液氮中，這也可能導致冷休克誘導的細胞裂解或損壞細胞膜，防止這種情況的一種方法是逐漸降低溫度，例如在 4 度下存放幾個小時，然后轉至 -20 度過夜，然后在-70度下儲存幾天然后轉移到液氮罐中，按照這種循序漸進的方法不僅可以使細胞適應較低的溫度，還可以確保它們不會發(fā)生冷致壞死導致細胞膜損傷和裂解。

細胞凍存步驟：

1.細胞冷凍前務必檢查細胞活力。它們細胞活力至少92%以上。

2. 準備好冷凍介質（FBS 中的 10% DMSO）處于低溫狀態(tài)。

3. 將細胞以 1000 RMP 離心 5 分鐘。準備標記的低溫小瓶。細胞濃度應約為例如從 50 毫升燒瓶中收集的約 5000 萬個細胞。您可以有 10 個小瓶，每個小瓶大約有 50 萬個細胞。

4. 離心后，*清除培養(yǎng)基，輕輕敲擊沉淀物使其松散。用移液管加入 5 mls 的冷凍介質重懸細胞，并將 0.5 ml 轉移到每個小瓶中。蓋緊蓋子，將低溫管放入底部有酒精的特殊低溫容器中并逐漸冷卻，它們通常最多可容納 20 個小瓶。

5. 關閉頂部并將容器轉移到-80冰箱。

細胞解凍步驟：
1.解 凍細胞的速度要快，取出裝有一些液氮的小瓶，置于水浴鍋中加溫解凍。

2. 細胞解凍時，注意保持瓶子密封，放置水浴鍋中的誰污染細胞，同時也要避免去污劑、細菌等進入細胞內。

3. 當冷凍細胞培養(yǎng)基幾乎解凍一半時（大約幾分鐘），可向細胞中加入 0.5 份溫培養(yǎng)基，然后立即轉移到裝有約 10 至 15 毫升溫培養(yǎng)基的燒瓶中。

4. 此時DMSO被稀釋，可以細胞活性檢查。細胞解凍結束后即可進入下一環(huán)節(jié)的實驗。