根據(jù)文獻(xiàn)方法部分描述，研究團(tuán)隊(duì)在原位雜交（In situ hybridization）中使用了AAT Bioquest的Styramide™ Signal Amplification (PSA™)系統(tǒng)（酪胺信號(hào)放大技術(shù)），具體用于檢測(cè)（DIG）標(biāo)記的探針。以下是詳細(xì)解析：

一、標(biāo)記對(duì)象與標(biāo)記方法

1.標(biāo)記對(duì)象：

①針對(duì)斑馬魚嗅覺(jué)玫瑰花結(jié)（Olfactory Rosette, OR）中的 paqr5b mRNA，使用DIG標(biāo)記的反義RNA探針（Antisense probe）。

②通過(guò)抗DIG-POD（辣根過(guò)氧化物酶）結(jié)合探針后，利用酪胺信號(hào)放大系統(tǒng)增強(qiáng)熒光信號(hào)。

2.標(biāo)記步驟：

①探針結(jié)合：DIG標(biāo)記的RNA探針與目標(biāo)mRNA結(jié)合

②酶聯(lián)反應(yīng)：使用抗DIG-POD抗體（Fab片段）與探針結(jié)合。

③信號(hào)放大：加入HRP底物（酪胺衍生物Styramide™），在HRP催化下，酪胺底物被激活并共價(jià)沉積在目標(biāo)位點(diǎn) 附近，形成高密度的熒光標(biāo)記。

二、染料的優(yōu)點(diǎn)與特點(diǎn)

特性	TSA技術(shù)	傳統(tǒng)熒光標(biāo)記	堿性磷酸酶系統(tǒng)
靈敏度	提高10-100倍	低	中等
空間分辨率	高（局部沉積）	低（擴(kuò)散背景）	中等
多色兼容性	支持多通道（FITC/Cy3/Cy5）	有限	需不同顯色底物
適用樣本	組織切片、低豐度靶標(biāo)	高表達(dá)靶標(biāo)	中等表達(dá)靶標(biāo)

三、文獻(xiàn)中的實(shí)驗(yàn)流程與結(jié)果

1. 樣本固定與切片
↓
2. 探針雜交（DIG標(biāo)記的paqr5b反義探針）
↓
3. 抗DIG-POD抗體結(jié)合
↓
4. Styramide™ PSA信號(hào)放大（HRP催化）
↓
5. 熒光顯微鏡成像
↓
6. 定量分析（如神經(jīng)元密度與信號(hào)強(qiáng)度）

顯微圖像示例

斑馬魚嗅覺(jué)玫瑰花結(jié)（OR）的paqr5b mRNA定位（文獻(xiàn)圖8：左為野生型，右為突變體；紅色箭頭指示paqr5b mRNA信號(hào)缺失）

結(jié)果解讀：

①野生型斑馬魚OR中，paqr5b mRNA在神經(jīng)元中高表達(dá)（綠色熒光信號(hào)）。

②paqr5b?/?突變體中，信號(hào)消失，證實(shí)基因敲除有效性。

③TSA技術(shù)的高靈敏度揭示了神經(jīng)元亞群中的細(xì)微表達(dá)差異。

總結(jié)

AAT Bioquest的Styramide Signal Amplification系統(tǒng)通過(guò)酶促信號(hào)放大與高分辨率熒光標(biāo)記，成為復(fù)雜生物樣本研究的“黃金標(biāo)準(zhǔn)"。其在低豐度靶標(biāo)檢測(cè)、多色復(fù)用及精細(xì)結(jié)構(gòu)成像中的優(yōu)勢(shì)，為神經(jīng)科學(xué)、癌癥研究與發(fā)育生物學(xué)提供了不可替代的技術(shù)支持。結(jié)合本文案例，該技術(shù)未來(lái)在單細(xì)胞組學(xué)與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)中的應(yīng)用潛力巨大。

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