人內源性分泌型糖基化終產(chǎn)物受體（esRAGE）酶聯(lián)免疫試劑盒使用說明

本試劑盒適用于以下樣本的測試（黑底字體為適用樣本）：

血清、血漿- 組織勻漿 –腹水 –細胞培養(yǎng)上清

本試劑盒僅供研究，不用于臨床診斷

目錄

1.     實驗原理

2.     試劑盒組成

3.     試劑盒保存

4. 需要而未提供的試劑和器材

5.     試劑準備

6.     樣本前處理

7.     洗板方法

8.     詳細操作程序

9.     操作總結

10.  性能參數(shù)

1.     實驗原理：本試劑盒采用競爭法法檢測樣本中內源性分泌型糖基化終產(chǎn)物受體（esRAGE） 的含量。向預先包被了抗體的酶標孔中加入樣本，再加入辣根過氧化物酶標記的識別抗原，在37℃下孵育1小時，兩者與固相抗原競爭結合形成免疫復合物，經(jīng)PBST洗滌后，結合的HRP催化TMB（四甲基聯(lián)苯胺）成藍色，隨后在酸的作用下轉化成黃色，在450nm波長下有吸收峰，吸光值與樣本中抗原的濃度成負相關。

2.試劑盒組成：

備注：

a． 試劑盒中“樣品稀釋液”為0.05M的PBS，“終止液”為2M的H2SO4，洗滌液為含0.15%吐溫-20的PBST，如不夠可自行配制。

b.不同公司的緩沖體系存在較大差異，請勿將本試劑盒的試劑與其他公司的試劑混用以免影響實驗結果。

c.濃縮洗滌液在低溫下會有少量鹽類析出，稍微加溫后即會消失，不影響使用。

3.試劑盒保存

本試劑盒可以在2-8℃下保存6個月，在-20℃下可以保存更長的時間。酶標板為真空包裝，板條可以拆卸，拆開以后如一次不能用完，請放入提供的密封袋中，放入干燥劑，2-8℃保存，在一個月之內仍然有效。試劑不能反復凍融。

4．需要而未提供的試劑和器材

1．37℃恒溫箱。

2．標準規(guī)格酶標儀。

3．精密移液器及一次性吸頭

4．雙蒸水或超純水

5．干凈的試管或Eppendof管

6．吸水紙

7．自動洗板機或8道排槍

8．ELISA數(shù)據(jù)處理軟件，推薦使用ELISACalc

9．500ml燒杯的和適當量程的量筒

5試劑準備

a.      使用前所有試劑應置于室溫平衡至少30分鐘。

b.     本試劑盒可以直接加樣，如濃度過高，可以進行適當比例的稀釋（推薦2-5倍稀釋），計算時應將結果乘以稀釋的倍數(shù)。

c.     洗滌液為25倍濃縮液，使用前將所有洗滌液倒入500ml或1L的燒杯中，用雙蒸水定容到500ml即為工作液。

d.     標準品的稀釋：取5支干凈的Eppendorf管，每管加150μl的標準品稀釋液，分別標記上800pg/ml,400pg/ml, 200pg/ml,100pg/ml, 50pg/ml.取150μl標準品原液加入標記800pg/ml的管中，混勻后同樣取出150μl，加入下一管，以此類推直至zui后一管。零孔：直接加標準品/樣品稀釋液。（見下圖）

    原液1600pg/ml    800pg/ml     400pg/ml     200pg/ml    100pg/ml   50pg/ml

6樣本前處理

a.標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。
b.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。
c.血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
d.尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
e.細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
f.組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?span lang="EN-US">2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

7洗板方法

a.      手工洗板：先洗去酶標孔中的的液體，在吸水紙上拍干，然后每孔加入300μl稀釋好的洗滌液，輕輕搖晃30秒，然后甩掉，在吸水紙上拍干，重復4-5次。

b.     洗板機洗板：洗板機洗板比較便捷，但應操作熟練后使用。

8詳細操作程序

a.      使用前請先將試劑盒在室溫下平衡半小時。

b.     空白孔不加樣，只加顯色劑A，B和終止液用于調零。

c.     標準品孔：每孔加入稀釋好的標準品50μl，零孔加入標準品/樣品稀釋液50μl，然后加入酶標試劑50μl。

d.     樣品孔：加入樣品50μl（推薦直接加樣，濃度高可以用樣品稀釋液稀釋2-5倍），然后加入酶標試劑50μl。

e.      輕輕搖晃，蓋上封板膜，37℃培養(yǎng)箱中孵育60min。

f.       將25倍濃縮洗滌液用蒸餾水25倍稀釋后備用。

g.     洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

h.     顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘。

i.         終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

j.        測定：以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后10分鐘以內進行。

k.      計算：根據(jù)濃度和OD值算出標準曲線的回歸方程，建議用計算軟件進行計算，推薦使用ELISAcalc進行計算，擬合模型選用logistic曲線（四參數(shù)）。標曲示意圖如下：

9操作總結

準備試劑，樣品和標準品

加入準備好的樣品和標準品，酶標試劑，37℃反應60分鐘

洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10分鐘

加入終止液

10分鐘之內讀OD值

計算

10性能參數(shù)

a.      批內差：CV＜10%

b.     批間差：CV＜12%

c.     靈敏度：20pg/ml

d.  保存：    2-8℃

e.  規(guī)格：    96T/盒

f.  有效期：  6個月（2-8℃）。