將標(biāo)記有熒光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變性，低溫復(fù)性，適溫延伸的熱循環(huán)，并遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律，與模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反應(yīng)體系中，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長，通過實時檢測與之對應(yīng)的隨擴增而變化熒光信號強度，求得Ct值，同時利用數(shù)個已知模板濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對照，即可得出待測標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)。

　　Ct值（Cyclethreshold，循環(huán)閾值）的含義為：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

　　1. 熒光閾值（threshold）的設(shè)定

　　PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺?。J(rèn)）設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold= 10*SDcycle 3-15

　　2. Ct值與起始模板的關(guān)系

　　每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，公式如下。

　　Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)

　　n為擴增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，X0為初始模板量，Ex為擴增效率，N為熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量。

　　起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。