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酮體是由肝臟產(chǎn)生的，當(dāng)血糖水平下降時(shí)，其外圍可用作能量來源。兩個(gè)主要的酮體是β-羥基丁酸酯（Beta-HB）和乙酰乙酸酯，而丙酮是第三大酮體。通常，在禁食和長時(shí)間運(yùn)動(dòng)期間，這兩個(gè)主要的酮體在血液中的含量很少。在患有糖尿病，酒精或水楊酸鹽中毒，激素缺乏癥，兒童低血糖癥和其他急性疾病的患者中，血液中會(huì)發(fā)現(xiàn)大量的酮體。血液中酮體的過度產(chǎn)生和積累（酮癥）可導(dǎo)致病理性代謝性酸中毒（酮癥酸中毒）。在情況下，酮癥酸中毒可能是致命的?？梢粤炕?beta;-HB的血酮測試方法 血液中的主要酮體（約75％）已用于診斷和監(jiān)測酮酸中毒的治療。Amplite™熒光β-羥基丁酸熒光測定試劑盒提供了靈敏的熒光測定法，用于測量生物樣品中的β-HB水平。該測定基于β-HB的酶偶聯(lián)反應(yīng)，其中產(chǎn)物NADH可通過熒光NADH傳感器進(jìn)行特異性監(jiān)測。熒光信號(hào)可以通過熒光酶標(biāo)儀讀取。使用這種熒光β-羥基丁酸熒光測定試劑盒，我們能夠在100 µL反應(yīng)體積中檢測到低至1.4 µM Beta-HB。該測定基于β-HB的酶偶聯(lián)反應(yīng)，其中產(chǎn)物NADH可通過熒光NADH傳感器進(jìn)行特異性監(jiān)測。熒光信號(hào)可以通過熒光酶標(biāo)儀讀取。使用這種熒光β-羥基丁酸熒光測定試劑盒，我們能夠在100 µL反應(yīng)體積中檢測到低至1.4 µM Beta-HB。該測定基于β-HB的酶偶聯(lián)反應(yīng)，其中產(chǎn)物NADH可通過熒光NADH傳感器進(jìn)行特異性監(jiān)測。熒光信號(hào)可以通過熒光酶標(biāo)儀讀取。使用這種熒光β-羥基丁酸熒光測定試劑盒，我們能夠在100 µL反應(yīng)體積中檢測到低至1.4 µM Beta-HB。
| 熒光酶標(biāo)儀 | |
| 激發(fā) | 540納米 |
| 發(fā)射 | 590納米 |
| 隔斷 | 570納米 |
| 推薦板 | 純黑色 |
| 組分A：酶混合物 | 2瓶（凍干粉） |
| 組分B：測定緩沖液 | 1瓶（10毫升） |
| 成分C：NAD | 1個(gè)小瓶 |
| 組分D：β-羥基丁酸（β-HB）標(biāo)準(zhǔn) | 1小瓶（10 µL） |
- 準(zhǔn)備β-HB標(biāo)準(zhǔn)品或測試樣品（50 µL）
- 加入β-HB工作溶液（50 µL）
- 在室溫下孵育10-30分鐘
- 監(jiān)測Ex / Em = 540/590 nm時(shí)的熒光增加
重要說明
為了獲得*效果，強(qiáng)烈建議使用黑色印版。開始實(shí)驗(yàn)前，在室溫下解凍每個(gè)試劑盒成分的小瓶。
儲(chǔ)備溶液的制備
除非另有說明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。
1. NAD儲(chǔ)備溶液（100X）：
將100 µL H 2 O加入NAD小瓶（組分C）中，制成100X NAD儲(chǔ)備溶液。
2.β-HB標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mM）：
將1 mL H 2 O或1X PBS緩沖液加到β-HB標(biāo)準(zhǔn)瓶（組分D）中，制成100 mMβ-HB標(biāo)準(zhǔn)溶液。
配制標(biāo)準(zhǔn)溶液
為了方便起見，請使用我們的系列稀釋計(jì)
將10 µL的β-HB標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mM）加入990 µL 1x PBS緩沖液中，以生成1000 µM的β-HB標(biāo)準(zhǔn)溶液（HB7）。取1000 µMβ-HB標(biāo)準(zhǔn)溶液，并在1x PBS中進(jìn)行1：3連續(xù)稀釋，以獲得β-HB標(biāo)準(zhǔn)（HB6-HB1）的連續(xù)稀釋液。注意：稀釋的β-HB標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。
準(zhǔn)備工作溶液
1.將5 mL測定緩沖液（組分B）加入一瓶酶混合物（組分A）中。
2.將50 µL NAD儲(chǔ)備溶液添加到組分A + B的瓶子中，并充分混合以制成β-HB工作溶液（組分A + B + C）。注意：此β-HB工作溶液不穩(wěn)定，請立即使用，并避免直接暴露在光線下。
程序
表1.在透明的底部96孔微孔板中的β-HB標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品的布局。HB =β-HB標(biāo)準(zhǔn)品（HB1-HB7，1至1000 µM）；BL =空白對照；TS =測試樣品。
| BL | BL | TS | TS |
| 乙肝1 | 乙肝1 | ... | ... |
| 乙肝2 | 乙肝2 | ... | ... |
| 乙肝3 | 乙肝3 | ||
| 乙肝4 | 乙肝4 | ||
| 乙肝5 | 乙肝5 | ||
| 乙肝6 | 乙肝6 | ||
| 乙肝7 | 乙肝7 |
表2.每個(gè)孔的試劑組成。
| 好 | 體積 | 試劑 |
| HB1-HB7 | 50微升 | 連續(xù)稀釋（1至1000 µM） |
| BL | 50微升 | 1X PBS緩沖液 |
| TS | 50微升 | 測試樣品 |
- 根據(jù)表1和表2提供的布局，將β-HB標(biāo)準(zhǔn)品（HB），空白對照（BL）和測試樣品（TS）制成黑色96孔微孔板。對于384孔板，請使用25 µL每孔試劑，而不是50 µL。
- 將50 µLβ-HB工作溶液添加到β-HB標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照和測試樣品的每個(gè)孔中，以使總體積為100 µL /孔。對于384孔板，將25 µLβ-HB工作溶液添加到每個(gè)孔中，總體積為50 µL /孔。
- 在避光條件下，于室溫下孵育反應(yīng)10-30分鐘。
- 使用熒光板讀數(shù)器在激發(fā)= 530-570 nm，發(fā)射= 590-600 nm（*Ex / Em = 540/590 nm，在570 nm截止）下監(jiān)測熒光的增加。
數(shù)據(jù)分析
1e+4100010010010- Dose-responseData legendGenerated with Quest Graph™β-Hydroxybutyrate (uM)RFUHover mouse to interact
從空白標(biāo)準(zhǔn)孔獲得的讀數(shù)（RFU）用作陰性對照。從其他標(biāo)準(zhǔn)的讀數(shù)中減去該值即可得到基線校正值。然后，繪制標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)，以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程式。該方程可用于計(jì)算β-羥基丁酸酯樣品。
