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免疫染色實驗方法和步驟

2019-12-9  閱讀(472)


1. 樣品準備(Sample preparation)
   對于貼壁細胞:
    可以直接用多孔板,例如6孔板、24孔板等,培養(yǎng)細胞,然后到預定時間時進行固定等后續(xù)操作。
    也可以用潔凈的蓋玻片,70%乙醇中浸泡后,用無菌的鑷子放置到6孔板內(nèi),然后用無菌的生理鹽水、PBS或培養(yǎng)液洗去殘留的乙醇。這時就可以種入細胞進行培養(yǎng),待細胞貼在蓋玻片上生長良好后,即可進行固定等后續(xù)操作。
   對于懸浮細胞:
    把細胞先在固定液中固定,然后把細胞滴加在載玻片上,干燥后細胞會緊貼在載玻片上。然后就可以進行后續(xù)操作。如果細胞的粘附能力不佳,可以在載玻片上用PDL等物質(zhì)進行處理,以增強載玻片的粘附能力。
   對于冷凍切片:
    切片放置在載玻片上后,可以直接進行固定等后續(xù)操作。
   對于石蠟切片:
    脫蠟:切片在二甲苯中脫蠟5分鐘,再換用新鮮的二甲苯脫蠟,共用二甲苯脫蠟3次。無水乙醇5分鐘,兩次。90%乙醇5分鐘,兩次,70%乙醇5分鐘,一次。蒸餾水5分鐘,兩次。
    抗原修復:根據(jù)不同的抗原和抗體,可以選擇把切片放置在如下抗原修復液中,10mM檸檬酸鈉,pH6.0,或1mM EDTA,pH8.0,或10mM Tris, pH10.0,95℃加熱12分鐘,大約在30分鐘內(nèi)緩慢冷卻至室溫。
2. 固定
    可以使用適當?shù)墓潭ㄒ汗潭毎蚯衅?,例如生產(chǎn)的免疫染色固定液(P0098)。固定完畢后,可以用免疫染色洗滌液(P0106)洗滌兩次,每次5分鐘。
3. 封閉(Blocking)
    加入免疫染色封閉液(P0102),封閉60分鐘。如果背景較高,可以4℃封閉過夜。
    從封閉開始所有的步驟,一定要注意樣品的保濕,避免樣品的干燥,否則極易產(chǎn)生較高的背景。
    在整個免疫染色過程中我們推薦使用的側(cè)擺搖床(E0018/E0019/E0025/E0035),側(cè)向擺動速度比較緩慢,而且也容易讓溶液覆蓋樣品。如果樣品比較容易脫落,也可以把所有的步驟放置在桌面上靜止進行,即封閉、抗體孵育、洗滌等步驟均不需搖動,但靜止操作時宜適當延長作用時間或次數(shù)。
4. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
    參考一抗的說明書,按照適當比例用免疫染色一抗稀釋液(P0103)稀釋一抗。
    用微型臺式真空泵(E0110/E0113)吸盡封閉液,立即加入稀釋好的一抗,室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳,可以4℃緩慢搖動孵育過夜。
    回收一抗。加入免疫染色洗滌液, 在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5分鐘。吸盡洗滌液后,再加入洗滌液,洗滌5分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。
5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
    參考二抗的說明書,按照適當比例用免疫熒光染色二抗稀釋液(P0108)稀釋熒光標記的二抗,或者用免疫染色(非熒光)二抗稀釋液(P0110)稀釋辣根過氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或堿性磷酸酯酶(AP)標記的二抗。辣根過氧化物酶(A0201/A0208/A0216)可向訂購。
    用微型臺式真空泵吸盡洗滌液,立即加入稀釋好的二抗,室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。
    回收二抗。加入免疫染色洗滌液, 在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5分鐘。吸盡洗滌液后,再加入洗滌液,洗滌5分鐘。共洗滌3次。如果結(jié)果背景較高,可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。
6. 蛋白檢測(Detection of proteins)
    對于免疫熒光染色,此時已經(jīng)可以直接到熒光顯微鏡下觀察。
    對于非免疫熒光染色可以選用DAB等適當?shù)娘@色底物,或AB檢測體系等進行后續(xù)檢測。
7. 多重染色(Multiple staining)
    如果進行的是免疫熒光染色,通常都可以進行多重染色。對于可以產(chǎn)生有色沉淀物的染色反應(yīng),例如DAB染色,一般不適合再進行多重染色。
    多重熒光染色:
    可使用紅色熒光、綠色熒光和藍色熒光進行三重熒光染色。例如用免疫熒光染色試劑盒-抗小鼠Cy3(P0193)進行紅色熒光染色,隨后可以用免疫熒光染色試劑盒-抗兔FITC(P0186)進行綠色熒光染色,在完成上述兩種染色后可以使用Hoechst染色試劑盒(C0003)對細胞核進行染色,染色后為藍色熒光。
    用HE染色進行復染:
 



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