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(一)總RNA提取

取液氮凍存腦組織置于玻璃勻漿器中，按100g:3ml的比例加入Trizol試劑，嚴(yán)格按照TrizolRNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的流程進(jìn)行。
(1)加Trizol（按3ml/100mg組織，寧多勿少）置于玻璃勻漿器中勻漿后，冰浴10-15min。

(2)移入1.5mlEP管中，4ºC 13000g離心10min。

(3)上清液移至另一EP管中，室溫放置10-15min。

(4)加入0.2ml/1mlTrizol，振蕩15s，室溫置5min。

(5)4ºC 12000g離心15min。

(6)仔細(xì)吸取上層水相，移至新的EP管中。

(7)加入0.5ml異丙醇/1mlTrizol，振搖，置室溫10min。

(8)4ºC 12000g離心10min，EP管底部可見(jiàn)白色沉淀物。

(9)棄上清，紙巾吸干，加入75%乙醇1ml，振搖，充分洗滌沉淀。

(10)4ºC 11000g離心5min。

(11)吸盡乙醇，空氣干燥10min（可離心加快干燥，盡量吸盡離心液體）。

(12)半透明時(shí)將RNA溶于去核酸酶的水20ul中（可吹打混勻），-20ºC凍存?zhèn)溆谩?/p>

(13)所提取的總RNA用核酸蛋白分析儀分析RNA含量和純度，所有標(biāo)本260/280nm吸光度的比值均為1.8-2.0。

(14)取所提取的總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳，顯示出清晰的28s和18s兩條rRNA。

(二)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

DEPC水 9ul
dig primer 1ul
5×buffer 4ul
10M dNTPmix 2ul
RNA酶抑制劑 1ul
總RNA 2ul 70ºC 5min
**********************************************************
逆轉(zhuǎn)錄酶 1ul
**********************************************************
20ul 42ºC 60min(+?)
70ºC 10min
4ºC ∞

(三)PCR反應(yīng)

DEPC水（可用高壓雙蒸水） 17.5ul
10×Taq buffer 2.5ul
MgCl2 2.0ul
10M dNTP Mix 0.5ul
上游引物 0.5ul
下游引物 0.5ul
Tap酶(5u/ul) 0.5ul
總CDNA 1.0ul
*********************************************************
25ul
PCR儀參數(shù)設(shè)置
94 ºC
5min 94 ºC ? ºC 72 ºC
30s 45s 45s 72ºC 4ºC
7min ∞

(四)電泳

(1)20ml 0.5×TBE

0.3-0.4g瓊脂糖
煮沸，配成1.5-2.0%瓊脂糖凝膠（RNA為1.0%）

(2)冷切至60 ºC，加入4ulEB，倒入槽中（8孔梳），室溫冷切30min

(3)拔梳，加入4ulPCR產(chǎn)物+1ul上樣緩沖液

(4)電壓100-135V

(5)UVP成像系統(tǒng)觀察

試劑配制
5×TBE配制方法（1L計(jì)）
Tris-Base 54g
硼酸 27.5g
EDTA 3.72g
加雙蒸水至1L
2%瓊脂糖凝膠配制方法
瓊脂糖 0.4g
0.5×TBE 20ml
EB 4ul
方法的改進(jìn)版：室溫冷切10min，放至4ºC冰箱20min

相關(guān)技巧

1、注意反應(yīng)體系的一致，可分裝

2、先P內(nèi)參，檢驗(yàn)CDNA的完整性

3、首先考慮退火溫度

4、注意引物的設(shè)計(jì)

5、若目的條帶無(wú)法到達(dá)位置，可先或晚于MAKER電泳

6、通過(guò)加量或減量PCR產(chǎn)物來(lái)達(dá)到灰度的調(diào)整

7、必要時(shí)可行標(biāo)本間替代

8、可設(shè)計(jì)相應(yīng)大小的內(nèi)參來(lái)達(dá)到終目的

9、2度水浴箱的妙用

10、必要時(shí)進(jìn)行相關(guān)技術(shù)處理