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脂肪酸合成酶（FAS）試劑盒,微板法

脂肪酸合成酶（FAS）試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 脂肪酸合成酶（Fatty acid synthetase，FAS）試劑盒說明書 （貨號(hào):WS3290W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 脂肪酸合成酶（FAS，EC 2.3.1.85）是脂肪酸合成關(guān)鍵酶，催化乙酰輔酶 A 和丙二酰輔 酶 A 而生成長鏈脂肪酸。FAS 普遍表達(dá)于各種組織細(xì)胞中，在哺乳動(dòng)物肝、腎、腦、肺 和乳腺以及脂肪組織中表達(dá)豐富。 FAS 催化乙酰 CoA、丙二酰 CoA 和 NADPH 生成長鏈脂肪酸和 NADP+；NADPH 在 340nm 有吸收峰，通過測(cè)定 340nm 光吸收下降速率，進(jìn)而計(jì)算 FAS 活性大小。 二、測(cè)試盒組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 50mL×1 瓶 4℃保存 用前搖勻再用。 試劑一 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部，加 0.6mL 蒸餾水溶解備用。用不完的試劑 分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。 試劑二 粉劑 mg×2 支 -20℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部，分 別加 0.3mL 蒸餾水溶解備用。用不完的 試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融， 一周內(nèi)用完。 試劑三 液體 7mL×1 瓶 4℃保存 試劑四 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下或離心使粉劑落入底部，加 0.6mL 蒸餾水溶解備用。用不完的試劑 分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰。 四、脂肪酸合成酶（FAS）活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn)樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 取約 0.1g 組織（水分充足的果實(shí)樣本可取 0.2-0.3g），加入 1mL 提取液（用前搖勻再用）， 進(jìn)行冰浴勻漿，13000rpm，4℃離心 15min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取 液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000rpm 4℃離心 15min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 2、上機(jī)檢測(cè)： 1 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，所有試劑解凍至室溫（25℃）。 2 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 樣本 40 試劑一 10本試劑盒僅供科研使用 2 試劑二 10 試劑三 130 混勻，室溫（25℃）孵育反應(yīng) 10min。 試劑四 10 混勻，室溫（25℃）于 340nm 處立即讀取 A1，15min 后讀取 A2。△A=A1-A2。 【注】1. 若△A 值低于 0.008，可增加樣本加樣體積 V1（如增至 60μL，則試劑三相應(yīng)減少，但需控 制 A1 值低于 1.8）或延長孵育時(shí)間（如延長至 30min）再讀取 A2 值。 2. 若 A1 值超過 1.8，需減少樣本加樣體積 V1（如減至 20μL，則試劑三相應(yīng)增加），且△A 應(yīng) 小于 0.3。 3. 若下降趨勢(shì)不穩(wěn)定，可以每隔 20S 讀取一次吸光值，選取一段線性下降的時(shí)間段來參與計(jì)算， 相對(duì)應(yīng)的 A 值也代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘氧化 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活單位。 FAS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr)÷T=107.2×ΔA÷Cpr 2、按樣本鮮重計(jì)算： 單位定義：每克組織在每分鐘內(nèi)氧化 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 FAS(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T=107.2×ΔA÷W 3、按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 單位定義：每 104個(gè)細(xì)胞在每分鐘內(nèi)氧化 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 FAS(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.214×ΔA V---加入提取液體積，1 mL； V1---加入樣本體積，0.04mL； V2---反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L； d---96 孔板光徑，0.5cm； ε---NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm； W---樣本質(zhì)量，g； T---反應(yīng)時(shí)間，15min； 500---細(xì)胞數(shù)量，百萬； Cpr---蛋白濃度（mg/mL），建議使用本公司的 BCA 蛋白含量測(cè)定試劑盒。