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N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)試劑盒

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 1 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase, NAG)試劑盒說明書 （貨號：WS2350F 分光法 24 樣） 一、產(chǎn)品簡介： N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG，EC 3.2.1.52）是溶酶體中的一種酸性水解酶，廣 泛存在于各種組織、體液和細胞中，該酶活性變化與機體某些病理狀態(tài)密切相關(guān)。 NAG 分解 4-硝基酚-β-N-乙酰氨基葡萄糖生成對-硝基*酚（PNP），在 415nm 處檢測 該產(chǎn)物的升高速率，來計算 NAG 活力大小。 二、試劑盒組分與配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 30mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下使粉劑落入底部，再加 入 2.1mL 蒸餾水，充分溶解備用，用 不完的試劑仍-20℃保存； 試劑二 液體 6mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液體 35mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿（光徑 1cm）、臺式離心機、水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱、 可調(diào)式移液器。 四、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）活性測定： 建議正式實驗前選取 2 個樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實驗流程，避免實驗 樣本和試劑浪費！ 1、樣本的制備： ① 組織樣本：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本取 0.5g），加入 1mL 提取液，進行冰浴 勻漿。15000rpm， 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】：若增加樣本，按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 提取。 ② 細菌或細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細菌或細 胞，加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；15000 rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 【注】若增加樣本，可以按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 提取。 ③ 液體樣本：直接檢測。若渾濁，離心后取上清檢測。 2、上機檢測： ① 可見分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 415nm，蒸餾水調(diào)零。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 對照管 樣本 20 20 試劑一 80 蒸餾水 80 試劑二 100 100 迅速混勻，37℃保溫 30min 試劑三 600 600本試劑盒僅供科研使用 2 混勻，取全部上清液于 1mL 玻璃比色皿中，415nm 處測定吸光值 A， ΔA=A 測定-A 對照（每個測定管需設(shè)一個對照管）。 【注】：1.若ΔA 在零附近徘徊，可延長 37℃孵育時間 T（如增至 1 小時或更長），或增加加樣體積 V1 （如增至 50μL，則試劑二相應(yīng)減少）或增加取樣質(zhì)量 W（如增至 0.2g）。則改變后的 T 和 V1 和 W 需代入公式重新計算。 2.若 A 測定大于 1.5 或△A 大于 1.5，可縮短 37℃孵育時間 T（如減至 10min 或更短）或減少 加樣體積 V1（如減至 10μL，則試劑二相應(yīng)增加）。則改變后 T 和 V1 需代入公式重新計算。 五、結(jié)果計算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0187x + 0.0095；x 為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（nmol），y 為吸光值ΔA 。 2、按樣本蛋白濃度計算： 單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基*酚（PNP）定義為一個酶活性單位。 NAG 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0095) ÷0.0187]÷(V1×Cpr)÷T=89.1×(ΔA-0.0095)÷Cpr 3、按樣本鮮重計算： 單位定義：每克組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基*酚（PNP）定義為一個酶活性單位。 NAG 活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA-0.0095) ÷0.0187]÷(W×V1÷V)÷T=89.1×(ΔA-0.0095)÷W 4、按細菌或細胞密度計算： 單位定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基*酚（PNP）定義一個酶活單位。 NAG 活性(nmol/min/104cell)=[(ΔA-0.0095) ÷0.0187]÷(500×V1÷V)÷T=0.18×(ΔA-0.0095) 5、按液體體積計算： 單位定義：每毫升樣本每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基*酚（PNP）定義為一個酶活性單位。 NAG 活性(nmol/min/mL)=[(ΔA-0.0095) ÷0.0187]÷V1÷T=89.1×(ΔA-0.0095) V----加入提取液體積，1mL； V1----加入反應(yīng)體系中樣本體積，20μL=0.02mL； W----樣本質(zhì)量，g； 500----細胞或細菌總數(shù)，500 萬； T----反應(yīng)時間，30min； PNP 對分子質(zhì)量----139.11。 Cpr----樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒； 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1mg/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1ml 蒸餾水。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mg/mL。也可根據(jù)實際 樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 在 EP 管加入：20μL 標(biāo)準(zhǔn)品+180μL 試劑二+600μL 試劑三，混勻，取 200μL 至 96 孔板中，于 415nm 下讀取吸光值。 4 根據(jù)結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。