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α-L-鼠李糖苷酶測(cè)定試劑盒,微板法

α-L-鼠李糖苷酶測(cè)定試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase)活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū) （貨號(hào):WS0850W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase，EC 3.2.1.40）是一種水解酶，可以水解人們?nèi)粘?飲食中常見(jiàn)的黃酮苷類化合物。該酶廣泛分布于自然界的細(xì)菌和真菌等生物中。它在工業(yè) 上具有許多潛在的應(yīng)用價(jià)值。 本試劑盒采用對(duì)硝基酚-α-鼠李糖苷(PNPR)作為底物，生成黃色的對(duì)硝基苯fen（PNP）， 該產(chǎn)物在 405nm 處有吸收峰。通過(guò)檢測(cè) PNP 在 405nm 下的增加速率，即可得到α-L- 鼠李糖苷酶活性的大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 50mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前甩幾下或離心使試劑落 入底部，再加 1.1mL 蒸餾水溶 解混勻，若難溶解可超聲溶解。 試劑二 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液體 10mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、恒溫培養(yǎng)箱、研缽、蒸餾水。 四、α-L-鼠李糖苷酶活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本：取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿，4℃×12000rpm 離心 15min，取上清液待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例提取。 ② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（104）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。 ③ 液體樣本：可直接測(cè)定，或者適當(dāng)稀釋后測(cè)定。若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)為 405nm。 ② 所有試劑于 40℃水浴中預(yù)熱 20 min。 ③ 在 96 孔板中依次加入下列試劑： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 10 10 試劑一 20 試劑二 70 90 迅速混勻，40℃保溫 20min本試劑盒僅供科研使用 2 試劑三 100 100 混勻，5min 后立即于 405nm 下讀取吸光值 A，ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照（每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管）。 【注】：①若△A 的值非常低在零附近，可增加樣本量 V1（如增至 20μL，則試劑二相應(yīng)減少）或 延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T（如增至 30min 或更長(zhǎng)），則重新調(diào)整的 V1 和 T 須代入公式重新計(jì)算。 ②若△A 的值超過(guò) 1，則需要稀釋樣本，稀釋倍數(shù) D 代入計(jì)算公式； 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 53.937x - 0.0037，x 是標(biāo)準(zhǔn)品（PNP）摩爾質(zhì)量：μmol；y 是△A。 2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算： 酶活定義：在 40℃下，每克組織每小時(shí)水解 1μmoLPNPR 產(chǎn)生 PNP 定義為 1 個(gè)酶活單位。 α-L-鼠李糖苷酶(μmol/h/g 鮮重)=[(△A+0.0037)÷53.937]÷(W×V1÷V)÷T×D =5.56×(△A +0.0037)÷W×D 3、按照樣本蛋白濃度計(jì)算： 酶活定義：在 40℃下，每毫克蛋白每小時(shí)水解 1μmoLPNPP 產(chǎn)生 PNP 定義為 1 個(gè)酶活單位。 α-L-鼠李糖苷酶(μmol/h/mg prot)=[(△A+0.0037)÷53.937]÷(Cpr×V1)÷T×D =5.56×(△A +0.0037)÷Cpr×D 4、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 酶活定義：在 40℃下，每 104個(gè)細(xì)胞每小時(shí)水解 1μmoLPNPP 產(chǎn)生 PNP 定義為 1 酶活單位。 α-L-鼠李糖苷酶(μmol/h/104 cell)=[(△A+0.0037)÷53.937]÷(500×V1)÷T×D =0.011×(△A +0.0037)×D 5、按液體體積計(jì)算： 酶活定義：在 40℃下，每毫升液體每小時(shí)水解 1μmoLPNPP 產(chǎn)生 PNP 定義為 1 個(gè)酶活單位。 α-L-鼠李糖苷酶(μmol/h/mL)= [(△A+0.0037)÷53.937]÷V1÷T×D =5.56×(△A +0.0037) W---樣品質(zhì)量，g； V---提取液體積，1 mL； V1---上清液體積（mL），0.01mL； T---反應(yīng)時(shí)間，20 min=1/3h。 D---稀釋倍數(shù)，未稀釋即為 1； Cpr---上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過(guò)程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（10μmol /ml）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1mL 蒸餾水溶解，若有結(jié)晶析出，需 37℃ 水浴至wan全溶解。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2μmol/ml。也可根據(jù)實(shí)際樣本來(lái)調(diào)整標(biāo) 準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù) 10ul 的標(biāo)準(zhǔn)品+90ul 的試劑二，再加 100ul 的試劑三，于 405nm 處讀值；根據(jù)結(jié)果即可制作 標(biāo)準(zhǔn)曲線。