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上海邦景實業(yè)有限公司
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禽流感熒光定量PCR檢測試劑盒反應(yīng)五要素技術(shù)
2021-2-4 閱讀(168)
禽流感熒光定量PCR檢測試劑盒技術(shù)參數(shù)：
1. 符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1686-2005《新城疫病毒中強(qiáng)毒株檢測方法：熒光RT-PCR法》的檢測要求，可用于禽肉、禽類組織臟器、禽類排泄和分泌物，及其泄殖腔和咽喉拭樣中新城疫病毒的檢測。
2. 靈敏度：對于接種的雞胚尿囊液，檢測的zui高稀釋度可達(dá)10-8～10-7，與雞胚病毒分離方法的靈敏度接近。定量檢測線性范圍可達(dá)10-1010拷貝/ml。
3. 特異性：采用基因序列數(shù)據(jù)庫設(shè)計，并通過系統(tǒng)驗證，新城疫病毒RT-PCR能夠檢測所有已知新城疫病毒毒株。對于其它禽類感染因子，本試劑盒檢測結(jié)果為陰性。
4. 產(chǎn)品盒組成：（不包括新城疫病毒RNA提取試劑,用戶可采用通用型病毒RNA提取試劑盒或試劑盒的提取方法。） 組成成份（48T/kit） 規(guī)格 數(shù)量 RNA提取液 30ml 1瓶 DEPC水 5 ml 1瓶 新城疫病毒RT-PCR一步法反應(yīng)液 920ul 1管 逆轉(zhuǎn)錄酶（5U/ul） 48ul 1管 Taq HS酶（5U/ul） 24ul 1管 新城疫病毒陽性對照 100ul 1管 新城疫病毒陰性對照 100ul 1管 使用說明書 一份。
禽流感熒光定量PCR檢測試劑盒反應(yīng)五要素：
①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC好隨機(jī)分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。
⑤引物3’端的堿基，特別是zui末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴(kuò)增的靶序列zui有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
