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上海邦景實(shí)業(yè)有限公司
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如何處理上皮細(xì)胞株培養(yǎng)中遇到的問題
2018-10-18 閱讀(326)
如何處理上皮細(xì)胞株培養(yǎng)中遇到的問題
準(zhǔn)備一燒杯37°C的水。從液氮儲(chǔ)存中取出一管細(xì)胞，注意保護(hù)手和眼睛。擰松管蓋1/4圈，等待10秒鐘以釋放螺紋中可能殘留的液氮，再重新擰緊管蓋。將凍存管的下半部分置于37°C水浴中進(jìn)行解凍，直至凍存管內(nèi)僅剩余一小塊冰芯，使細(xì)胞迅速解凍。
用消毒液擦拭管體外表面，再將其移至II級(jí)A型層流細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥中。打開管蓋，使用1 mL移液器上下吹打細(xì)胞懸液以分散細(xì)胞。從管中吸取20 uL細(xì)胞懸液，并將其稀釋于20 uL臺(tái)盼藍(lán)溶液中（如：Gibco™臺(tái)盼藍(lán)，貨號(hào) 15250-061）。
使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板來確定每毫升懸液中的活細(xì)胞數(shù)。將管中懸液（1 mL）稀釋至產(chǎn)品說明中的濃度（例如1.25 x 10E4活細(xì)胞/毫升，Gibco™ 新生人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞）。將5 mL細(xì)胞懸液加入25 cm2培養(yǎng)瓶，或?qū)?5 mL細(xì)胞懸浮液加入75cm2培養(yǎng)瓶中。搖勻培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基以*分散細(xì)胞。許多類型的細(xì)胞都會(huì)迅速貼壁，如果沒有在傳代后即刻搖勻細(xì)胞，細(xì)胞可能生長不均勻。在37°C、5% CO2/95%空氣、濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。為獲得理想的結(jié)果，培養(yǎng)開始后至少在24小時(shí)之內(nèi)不要擾動(dòng)細(xì)胞。
是否需要在種板前離心細(xì)胞以去除凍存培養(yǎng)基？
我們不在種板前離心細(xì)胞以去除凍存培養(yǎng)基。尤其是在不適當(dāng)?shù)母咚贄l件下，離心對(duì)細(xì)胞有損傷。以我們Invitrogen™細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室目前經(jīng)驗(yàn)的來看，如果DMSO的濃度足夠低，不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害。因此，我們的產(chǎn)品說明中提供了一份詳細(xì)方案，其中包括如何使用的接種密度和培養(yǎng)基的體積稀釋細(xì)胞使得DMSO的終濃度低于0.4%（v/v）。
為何我的原代細(xì)胞生長變慢或停止生長？
原代細(xì)胞未經(jīng)永生化處理，因此群體倍增次數(shù)有限。每一種細(xì)胞類型都擁有不同的大群體倍增次數(shù)，這一參數(shù)可在產(chǎn)品批次的COA（certificate of analysis）上找到。
為何我的原代細(xì)胞復(fù)蘇后存活率如此之低？
收貨后立即將細(xì)胞保存于氣相液氮中很重要。這些凍存管并不能確保不發(fā)生滲漏，將它們浸入液氮的液相中可能會(huì)使液氮滲入管中，進(jìn)而影響細(xì)胞活力。
為何我的細(xì)胞無法依附于培養(yǎng)板/培養(yǎng)瓶表面？
從冰箱中取出血清并在2–8°C條件下過夜融化。隨后可在室溫下完成解凍過程。在這一過程中，血清應(yīng)規(guī)則地進(jìn)行混勻。
不要將FBS置于37°C條件下孵育過長時(shí)間，否則產(chǎn)品可能會(huì)變混濁。由于血清中許多成份存在敏感性，其性能也可能受到影響。產(chǎn)品一旦解凍，建議您立即使用。
