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上海邦景實(shí)業(yè)有限公司
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單克隆抗體制備具體步驟
2025-7-8 閱讀(1)
單克隆抗體制備技術(shù)最初是由K鰄ler和Milstein(1975)利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)創(chuàng)立的。單克隆抗體是由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體，常通過雜交瘤細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行制備，具有高特異性，往往不需要親和純化。B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合可產(chǎn)生既具有分泌特異性抗體又具有在組織培養(yǎng)中無限增殖能力的雜交瘤細(xì)胞。通過篩選、克隆和增殖后，可以實(shí)現(xiàn)單克隆抗體的工業(yè)化生產(chǎn)。
目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于疾病診斷及生物、醫(yī)學(xué)研究、環(huán)境和食品安全檢測(監(jiān)測)等方面。單抗均一性高，只和抗原某一決定簇結(jié)合，有更高的特異性，而且，產(chǎn)生抗體的單克隆細(xì)胞可在體外傳代繁殖，不受動物免疫時(shí)間限制生產(chǎn)抗體。只要管理和培養(yǎng)技術(shù)正確，抗體就可無限的產(chǎn)生?；具^程是動物免疫、細(xì)胞融合、克隆篩選、單克隆抗體性質(zhì)鑒定、腹水誘發(fā)、收集和純化等。
具體步驟包括：
1、動物免疫：抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生可分泌目標(biāo)抗體的B淋巴細(xì)胞。
2、細(xì)胞融合：制備脾細(xì)胞懸液，將其與同系骨髓瘤細(xì)胞按一定比例混合，在細(xì)胞促融劑聚乙二醇的作用下，各種淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞。
3、HAT選擇性培養(yǎng)：篩選融合的雜交瘤細(xì)胞。在HAT培養(yǎng)基中，未融合小鼠骨髓瘤細(xì)胞的DNA合成途徑都被阻止，骨髓瘤細(xì)胞DNA不能復(fù)制而死亡，而未融合的B淋巴細(xì)胞本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從B淋巴細(xì)胞獲得了次黃C5H4N4-鳥C5H4N4-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，可以通過補(bǔ)救途徑合成DNA，并具有骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖的特性，因此，雜交瘤細(xì)胞能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。
4、雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆：對分泌目標(biāo)特異性單克隆抗體的細(xì)胞進(jìn)行篩選和克隆。通常采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。篩選和克隆完成后，需要對相應(yīng)的細(xì)胞進(jìn)行及時(shí)凍存。
5、單克隆抗體的增殖：通過動物體內(nèi)誘生法(腹水注射)和體外培養(yǎng)法(中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)器培養(yǎng))對單克隆抗體進(jìn)行大量制備。
