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上海邦景實(shí)業(yè)有限公司
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PCRR實(shí)驗(yàn)一般循環(huán)步驟
2024-12-23 閱讀(147)
PCR由變性——退火——延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。
準(zhǔn)備好各種試劑和PCR儀，就可以開(kāi)始PCR實(shí)驗(yàn)：將各種試劑混合并按照說(shuō)明書(shū)設(shè)置PCR反應(yīng)。一般PCR循環(huán)如下：
1、起始步驟：這對(duì)于熱啟動(dòng)PCR而言是必須的，將反應(yīng)混合液加熱至94~98℃以激活DNA聚合酶。這一步的時(shí)間取決于所選用的DNA聚合酶。
2、變性步驟：DNA本身是雙鏈結(jié)構(gòu)，而DNA擴(kuò)增需要引物與單鏈DNA模板相結(jié)合。在這一步，反應(yīng)混合液被加熱至94～98℃保持20～30秒以破壞雙鏈間的氫鍵以便釋放出單鏈DNA。這是PCR循環(huán)中的第一步。
3、退火步驟：變性之后，DNA模板以單鏈的形式在反應(yīng)混合液中存在。因?yàn)榉磻?yīng)體系中的引物與DNA模板互補(bǔ)，當(dāng)反應(yīng)溫度降至50~65℃時(shí)，引物與互補(bǔ)的序列形成氫鍵。退火溫度主要取決于引物的Tm值，通常比引物Tm值低3～5℃。這一步通常維持20～40秒，而聚合酶會(huì)結(jié)合至引物-模板雙鏈處開(kāi)始DNA合成。
4、延伸步驟：在這一步，DNA聚合酶開(kāi)始DNA合成，因此這一步的溫度選取的是DNA聚合酶的優(yōu)溫度。通常我們選用72℃，但某些DNA聚合酶的最適溫度是68℃。這一步與體內(nèi)的DNA復(fù)制很相似：DNA聚合酶按照堿基互補(bǔ)規(guī)律將dNTPs加到引物的3’末端最終得到新的DNA雙鏈片段。延伸時(shí)間取決于目的DNA片段的長(zhǎng)度和DNA聚合酶的合成能力。一般而言DNA聚合酶每60秒能夠合成1kb長(zhǎng)度的DNA。
5、循環(huán)：第2步至第4步稱(chēng)為一個(gè)循環(huán)。每次循環(huán)之后DNA的量均是前一次的兩倍。通常一次PCR反應(yīng)進(jìn)行30~35個(gè)循環(huán)。在前幾輪的PCR循環(huán)過(guò)程中PCR產(chǎn)物的量以指數(shù)速率增長(zhǎng)，但是到了反應(yīng)后期隨著dNTPs和引物的量的減少以及DNA聚合酶的失活，反應(yīng)速率逐漸下降，因此PCR反應(yīng)的產(chǎn)量也受到了限制。
6、最后的延伸步驟：當(dāng)30~35個(gè)循環(huán)結(jié)束后，我們通常會(huì)以68~74℃延伸5~10分鐘，這是希望使反應(yīng)體系中殘留的單鏈DNA全部反應(yīng)完畢。
7、保存溫度：通常我們?cè)O(shè)置4~10℃為反應(yīng)后PCR產(chǎn)物的保存溫度。
每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。
