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?抗體篩選鑒定流程
2024-4-22 閱讀(47)
抗體是哺乳動物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)對抗病原體的核心，它是在病原體刺激下由漿細(xì)胞（效應(yīng)B細(xì)胞）所分泌的一種免疫球蛋白，能夠識別并結(jié)合特異的病原體抗原，隨后通過介導(dǎo)中和作用、調(diào)理作用、效應(yīng)T細(xì)胞殺傷等來清除病原體。
抗體篩選鑒定推薦流程：
1.包被免疫管：將100ug 抗體加入到2mL PBS中并加入到免疫管中，4度過夜孵育。
2.封閉：將擴增和純化噬菌體文庫后的噬菌體 500ul 加入到1mL 3% BSA中，室溫旋轉(zhuǎn)孵育2h。同時往包被好的免疫管中加入2-3mL 3% BSA，室溫旋轉(zhuǎn)孵育2h。
3.抗原和噬菌體孵育：將封閉后的免疫管用含有0.01%吐溫的PBS洗3次，每次5分鐘。將封閉后的噬菌體文庫加入到封閉后的免疫管中，添加PBS直至2-3mL，室溫旋轉(zhuǎn)孵育1h。
4.清洗：將抗原和噬菌體孵育后的免疫管用含有0.01%吐溫的PBS洗20次，每次5分鐘。
5.洗脫：往免疫管中加入1mL 100mM Trimethymime，室溫孵育10分鐘，加入1M Tris-HCl中和Trimethymime，將最后1.5mL的洗脫噬菌體轉(zhuǎn)移到新的離心管中。
將洗脫的噬菌體按照擴增和純化噬菌體文庫 擴增后再重復(fù)篩選過程2次，逐次減半包被免疫管的抗體量，得到3次篩選后的洗脫噬菌體。
6.ELISA鑒定：將上一步篩選得到的噬菌體稀釋10^6倍后，取100ul加入到OD600為0.5的SS320菌液中，37度培養(yǎng)30分鐘后涂布含有四環(huán)素和氨芐霉素的2X YT培養(yǎng)板上，37度過夜培養(yǎng)第二天得到單克隆菌落。
挑選96個單克隆菌落到含有四環(huán)素和氨芐霉素的2X YT培養(yǎng)液的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，37度培養(yǎng)3-4小時后往培養(yǎng)孔中加入卡那霉su和20:1的輔助噬菌體，30度過夜培養(yǎng)。第二天將過夜培養(yǎng)后的細(xì)胞液離心，獲得上清液。
將過夜包被抗原和用3%BSA封閉過后的96孔ELISA板中加入上一步獲得的噬菌體上清液，室溫孵育1h。用含有0.05%吐溫的PBS清洗3次后，用噬菌體抗體抗體作為一抗，用相應(yīng)的二抗TMB顯色后在波長450讀取每個孔的吸光值。選取吸光值讀數(shù)最高的SS320菌落送去測序，得到抗體的基因序列。
抗體篩選技巧：
1. 合適量的抗原包被和抗原的分子量大小、疏水親水性質(zhì)、結(jié)構(gòu)有關(guān)，也和包被緩沖液和包被介質(zhì)的選擇有關(guān)，合理的包被是成功篩選的基礎(chǔ)，如果有必要可以進(jìn)行預(yù)實驗確定包被的條件。
2. 洗脫后測定噬菌體的效價，經(jīng)過2-4輪包被后篩選的富集程度需要在合理范圍之內(nèi)。
