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小鼠DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）試劑盒操作說明
閱讀：241 發(fā)布時間：2017-11-7小鼠DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）試劑盒操作說明
本試劑盒僅供研究使用。
使用目的：
本試劑盒用于測定小鼠血清、血漿及相關液體樣本中DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）
含量。
實驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中小鼠DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）水平。用
純化的小鼠DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗
的微孔中依次加入DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT），再與HRP標記的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶
（DNMT）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。
TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣
品中的DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD
值），通過標準曲線計算樣品中小鼠DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）濃度。
標本要求
1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能
馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融
2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
小鼠DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）試劑盒操作步驟
1.標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀
釋。
50U/L5號標準品150µl的原倍標準品加入150µl標準品稀釋液
25U/L4號標準品150µl的5號標準品加入150µl標準品稀釋液
12.5U/L3號標準品150µl的4號標準品加入150µl標準品稀釋液
6.25U/L2號標準品150µl的3號標準品加入150µl標準品稀釋液
3.125U/L1號標準品150µl的2號標準品加入150µl標準品稀釋液
2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、
待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50µl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40µl，
然后再加待測樣品10µl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡
量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用
5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此
重復5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶標試劑50µl，空白孔除外。
7.溫育：操作同3。
8.洗滌：操作同5。
9.顯色：每孔先加入顯色劑A50µl，再加入顯色劑B50µl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色
10分鐘.
10.終止：每孔加終止液50µl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
11.測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止
液后15分鐘以內(nèi)進行。
操作程序總結(jié)：
計算
以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的
OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標
準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，
即為樣品的實際濃度。
小鼠DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）試劑盒注意事項
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未
用完，板條應裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3．各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間
控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，*使用排槍加樣。
4．請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值
大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計
算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存。
7．嚴格按照小鼠DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）試劑盒說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9．本試劑不同批號組分不得混用。
保存條件及有效期
1．試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個月