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上海威正翔禹生物科技有限公司
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閱讀：776發(fā)布時間：2017-9-5
PCR污染是每個實驗室都多多少少會遇到的問題。原因在于，PCR是非常靈敏的一項檢測，100個拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽性擴增，從而容易出現(xiàn)DNA污染導(dǎo)致的假陽性。那么，怎樣遠(yuǎn)離PCR的污染呢？
圖 PCR污染之一瞥
首先，要辨別PCR污染的來源。設(shè)立陰陽性對照，有利于檢測反應(yīng)體系各成分的污染情況。尤其是設(shè)立空白對照，即包括PCR的全部組分，而不加模板DNA，這對檢測試劑中PCR產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。
在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污染了，則考慮可能為環(huán)境污染。環(huán)境污染的zui主要原因是DNA溶液的濺出和DNA氣溶膠造成的實驗區(qū)域的污染，這尤其在PCR產(chǎn)物擴增區(qū)容易出現(xiàn)。移液器槍頭和EP管架是也較常見的污染部位。
如果是環(huán)境污染，還可對每個區(qū)域進(jìn)行涂抹采樣和核酸提取，以zui終鑒定污染的區(qū)域所在。德國Minerva Biolabs公司專門生產(chǎn)有DNA污染監(jiān)測試劑盒（貨號181-0010和182-0010），比較方便使用。
對PCR的環(huán)境污染，有如下幾種治理方法：
1. 用常規(guī)消毒液定期在環(huán)境中噴霧消毒處理。
2. 稀酸處理法：對可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤；其缺點是鹽酸對皮膚有一定的腐蝕性。
3. 紫外照射法：紫外波長一般選擇254/300nm，照射30分鐘至2小時。但需要注意的是，UV照射僅對500bp以上長片段有效，對短片段效果不大。
4. 選用商品化的DNA污染祛除劑。我們推薦的是Minerva公司的PCR CleanTM 噴霧劑、濕巾。其1分鐘即起效，方便快捷，*，可同時去除DNA和RNA。作用1分鐘后，用紙巾擦拭，即可完成對DNA污染的清除。
對于PCR反應(yīng)液的污染，可采取以下方法：
1. DNase I 法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室溫反應(yīng)30min后加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進(jìn)行正常PCR擴增。
2. 內(nèi)切酶法：選擇識別4個堿基的內(nèi)切酶（如MspI和TaqI等），可同時選擇幾種，以克服用一種酶只能識別特定序列的缺陷，室溫作用1h后加熱滅活進(jìn)行PCR。
3. 紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進(jìn)行紫外照射，注意事項與方法同上述UV照射法。
4. *糖苷酶（UNG）法：用dUTP代替dTTP，使PCR產(chǎn)物中摻入大量dU。在再次進(jìn)行PCR擴增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染。由于UNG在PCR循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會影響含dU的新的PCR產(chǎn)物。
圖 UNG法預(yù)防污染
總之，靈敏度越高的PCR反應(yīng)越容易出現(xiàn)PCR污染。采用適當(dāng)?shù)拇胧┫廴?，可以避免重?fù)實驗和浪費試劑，也使得實驗結(jié)果更加可靠而。
參考資料:
1、唐艷榮，張海云，等。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）中主要污染源及處理方法的分析。農(nóng)業(yè)開發(fā)與裝備，2017（3）：99-100
2、周榮榮，李超。日照市疾病預(yù)防控制中心PCR實驗室污染情況調(diào)查。 醫(yī)學(xué)檢驗與臨床， 2017,28（5）：61-63
商鋪：http://www.hg1112.cn/st556336/
主營產(chǎn)品：進(jìn)口Ausbian胎牛血清,液體培養(yǎng)基,支原體祛除檢測劑,微生物培養(yǎng)基,細(xì)胞培養(yǎng)試劑,細(xì)胞分離液,動物細(xì)胞培養(yǎng),DNA污染防治,微生物工業(yè)品,疫苗檢測
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