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Whatman 離子交換纖維素在實(shí)驗(yàn)室中的用法
有關(guān)如何使得介質(zhì)獲得結(jié)果
達(dá)到分離結(jié)果
Whatman 公司已為蛋白質(zhì)、酶和核酸片斷等生物多聚物的有效分離特別開發(fā)了一系列Whatman 離子交換纖維素。在使用時(shí)只有確切的按注意事項(xiàng)操作才能得到分離效果。
介質(zhì)種類
| 類型 | 陰離子交 | 陽離子交 | 物理形態(tài) |
| 干品 | DE23 | CM23 | 纖維狀 |
| DE23 | CM32 | 微粒狀 | |
| 預(yù)溶脹 | DE51 | CM52 | 比52 型結(jié)合力較弱的微粒狀 |
| DE52 | 微粒狀 | ||
| DE53 | 比52 型結(jié)合力較弱的微粒狀 | ||
| QA52 | SE52 | 全離子化微粒 | |
| SE53 | 比52 型結(jié)合力強(qiáng)的全離子化微粒 |
交換劑的預(yù)處理
1． 預(yù)溶脹（51，52 和53）型離子交換劑不用預(yù)先反復(fù)處理就可使用。但必須用緩沖鹽充分平衡。預(yù)溶脹的離子交換劑在每次預(yù)處理或再生后使用不要用任何方法使它變干。
2． 為了得到盡可能好的結(jié)果，對(duì)于干的離子交換纖維素（23 和32）預(yù)處理的每一步必須按下面即將介紹的流程進(jìn)行操作。
3． DE51、QA52、SE52 和SE53 含防腐劑。此類物質(zhì)會(huì)在平衡和裝柱時(shí)自動(dòng)隨之除去。如果離子交換劑還進(jìn)行平衡，則防腐劑可以用蒸餾水或者去離子水進(jìn)行洗滌。
*部分 干型離子交換纖維素
預(yù)處理
1． 稱量好的的離子交換劑添加到 15 倍容積（W/V）酸或堿溶液中輕輕攪動(dòng)，進(jìn)行*次處理。
2． 微粒產(chǎn)品至少浸泡 30min，纖維狀產(chǎn)品至少浸泡60min。
3． 濾出上清液，用水洗至下列“中間 pH”。
4． 再用 15 倍容積的酸或堿溶液浸泡進(jìn)行二次處理，放置30min，濾出上清液。
5． 重復(fù)上述“4”二次處理，然后用水洗至洗液呈中性。
處理?xiàng)l件
| 型號(hào) | 一次處理 | 中間 pH | 二次處理 |
| DE | 0.5NHCl | 4.0 | 0.5NNaOH |
| CM | 0.5NNaOH | 8.0 | 0.5NHCl |
注意：對(duì)預(yù)溶脹的微粒狀產(chǎn)品（51，52 和53 型）不需進(jìn)行這一步，因此干型產(chǎn)品用在大規(guī)
模柱層析分離更好。
一般操作注意事項(xiàng)
- 離子交換劑可以在室溫下儲(chǔ)存
- 當(dāng)不用時(shí)可以一直密封保存
- 可以用蒸餾水，更好的是使用去離子水
- 為了避免離子交換劑顆粒變細(xì)，不可以激烈窯洞或者攪動(dòng)交換劑懸液
- 為了延長(zhǎng)使用期，離子交換劑不可以采用濃酸、濃堿或強(qiáng)氧化劑處理。為了再生。滅菌和去熱源，可以采用0.5N-2.0NNaOH 處理48 小時(shí)。
- 不添加防腐劑情況下，離子交換劑在緩沖液和多聚電解質(zhì)溶液中不要超過一周。陽離子交換劑（CM 和SE 類）采用0.1%（W/V）疊氮鈉、0.1%（W/V）2,2’-二硫雙（氧化吡啶）或0.02%（W/V）乙基汞硫化水楊酸鈉。陰離子交換劑（DE 和QA 類）用0.2%（W/V）烷基-二甲機(jī)-芐基氯化銨。
第二部分預(yù)溶脹型離子交換纖維素和預(yù)處理后的干型離子交換纖維素
交換劑懸浮液的準(zhǔn)備
一般 QA52 型和SE52 型全離子化交換劑在用低離子濃度緩沖液中平衡時(shí)間比DE52 和CM52 型更短。
而且所有介質(zhì)當(dāng)采用的緩沖液離子與離子交換劑的相一致時(shí)，所需的平衡液體積zui小，例如采用三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸緩沖液（Tris HCl Buffer）對(duì)DE 或QA 型離子交換劑平衡所需時(shí)間和體積都要比用醋酸鹽類緩沖鹽少。
所有情況下實(shí)際采用的起始緩沖液濃度比需要的起始緩沖液濃度高，（典型的高10 倍），這樣有利于交換劑的預(yù)平衡。下面介紹的是更可取的平衡方法。
離子交換劑裝柱后在進(jìn)樣品前必須用低離子濃度的緩沖液進(jìn)行平衡，通常將2-4 倍柱床容積的低濃度緩沖液通過填充柱就可以完成平衡。
的方法
1． 在使用之前用緩沖液（0.2-1.0M）輕輕搖動(dòng)攪拌離子交換劑2-3min。zui初取干型纖維素時(shí)每克干品約用15-30mL 緩沖液，濕離子交換劑約用6mL/g。
2． 在攪拌時(shí)緩沖液的酸或堿成分使緩沖液/離子交換劑懸液的pH 調(diào)到所希望的值。
3． 讓懸液沉降并傾出上清液中的細(xì)小顆粒。
4． 再次使用緩沖液使離子交換劑松散。干型離子交換劑懸液的總?cè)莘e按 30mL/g 計(jì)，濕離子交換劑約為6mL/g。
5． 離子交換劑和緩沖液的懸液在合適的量筒中沉降，并置于無灰塵、無直射陽光和不發(fā)熱的地方，沉降時(shí)間可按t = nh 式計(jì)算。式中：t = 時(shí)間（min），h = 量筒中懸液總高度（cm），n = 系數(shù)可取1.3~2.4。
6． 注意“濕沉降體積”是離子交換劑在規(guī)定條件下沉降后所占的體積。除去上清液中所含細(xì)粒后留在量筒中的zui終體積是“濕沉降體積”加20%。
7． 填裝短柱或長(zhǎng)柱時(shí)懸液可以選用上述密度，但是纖維狀產(chǎn)品的長(zhǎng)柱床的密度需用“濕沉降體積”加50%。
變換緩沖液可用的方法
1． 按上項(xiàng)（1）那樣輕輕攪拌離子交換劑到一定容積的緩沖液中。
2． 放置 10min，傾出或?yàn)V出上清液。
3． 重復(fù)處理直到濾液或上清液確實(shí)與緩沖液的 pH 和電導(dǎo)率一樣為止。變換緩沖液后必須
核對(duì)pH。當(dāng)采用低濃度緩沖液時(shí)本方法會(huì)有所變化，且需要增加處理的時(shí)間。
4． 除去細(xì)顆粒和裝柱的準(zhǔn)備工作請(qǐng)按上述（4）（5）和（6）項(xiàng)進(jìn)行。
裝柱
在裝柱時(shí)必須避免離子交換劑和緩沖液的對(duì)流翻動(dòng)。
為此必須使懸浮液倒入柱中瞬間使離子交換劑形成沉降柱床曾，操作進(jìn)行得盡可能快，否則懸液中的對(duì)流需很長(zhǎng)時(shí)間才會(huì)停下來。
1． 離子交換用柱應(yīng)該垂直置于無灰、無直射陽光和不發(fā)熱等環(huán)境中。
2． 假如選液體積大于柱體積時(shí)，應(yīng)該另外接一段延長(zhǎng)管。
3． 輕輕攪動(dòng)下將懸液倒入柱中。
4． 讓洗脫液從柱中排出。
5． 全部懸液加完后裝上或插入柱頂蓋。
6． 緩沖液用泵或流動(dòng)法通過柱子，流速控制至少 45ml/hr/cm2 柱子內(nèi)截面積，直到柱床高
度恒定。
7． 停止緩沖液流進(jìn)或流出柱子。
8． 取下延長(zhǎng)管（若裝著）并換上柱頂蓋。
平衡
需要強(qiáng)調(diào)的是必須正確讀取 pH 和電導(dǎo)率。
對(duì)真正的平衡而言平衡后的溶液應(yīng)該與起始緩沖液一致，必須做到不僅連續(xù)兩次平衡溶液的讀數(shù)相同，而且要去起始緩沖液相同。不正確的平衡是產(chǎn)生無重現(xiàn)性結(jié)果的原因。起始緩沖液流過柱子直到流出液的電導(dǎo)率和 pH 地與起始緩沖液相同。此方法適用于開始時(shí)用低濃度緩沖液的柱分離。
樣品準(zhǔn)備和加樣
樣品溶于起始緩沖液中并調(diào)整溶液的 pH。細(xì)胞提取物和硫酸銨沉淀物要用層析柱起始緩沖液透析。這一步不注意就有可能得到無法重現(xiàn)的結(jié)果。被分離物通常在低流速時(shí)加樣。
洗脫
加樣品后立刻開始洗脫或在規(guī)定時(shí)間內(nèi)開始。
層析分離通常采用三種方法。有分步洗脫、連續(xù)梯度洗脫和分段梯度洗脫。
分步洗脫
離子交換劑平衡和樣品混合物準(zhǔn)備時(shí)所有緩沖液也可在洗脫時(shí)用，洗脫可以有兩種方式完成：
1． 目的物分子是游離狀態(tài)的。所需離子交換劑量要根據(jù)混合物污染程度、結(jié)合力和成分不
同而定。柱床高度在這種方式操作中并不重要。
2． 目的物分子是結(jié)合狀態(tài)的。層析時(shí)混合物是由相類似的成分組成的，為了獲得分離
應(yīng)選用相對(duì)長(zhǎng)的柱子?？扇〉氖侵挥昧酥?cè)萘康暮苄∫徊糠郑ㄈ?%）。
應(yīng)避免離子交換劑平衡和柱中層析分離兩者選用不同的緩沖液，除非系統(tǒng)已經(jīng)明確顯出
會(huì)得到錯(cuò)誤的結(jié)果時(shí)才考慮。
梯度洗脫
連續(xù)地或分段地改變緩沖液的組分用于有效分離。緩沖液的組分變化可以是提高一種離子濃度或改變適當(dāng)?shù)膒H，或者兩者都改變。緩沖液本身是達(dá)到分離目的的主要因素，離子交換劑的量需要按離子交換劑對(duì)目的化合物的交換容量而定。萬一混合物含層析相近似的組分時(shí)，為了獲得好的分辨力需要稍增加些柱長(zhǎng)度。
特殊技術(shù)
滅菌
所有 whatman 離子交換介質(zhì)除P11 型之外為了滅菌都可以高壓滅菌。是離子交換劑用PH6.5~7.5 的非揮發(fā)性緩沖液配成的懸液中進(jìn)行。
建議的滅菌條件是 10psi/15min；或者15psi/10min；。另外除P11 型之外所有的產(chǎn)品也可
以用化學(xué)滅菌法，將介質(zhì)分散在0.5MNaOH 中，然后用滅菌水洗滌。所有產(chǎn)品也可用含
20~25%體積百分比的乙醇水溶液處理。
脫氣（對(duì)陰離子交換劑）
對(duì)大多數(shù)靈敏的分離，為了獲得重現(xiàn)性好的結(jié)果，DE 和QA 纖維素交換劑需除去吸附的二氧化碳。假如懸液預(yù)先按上述的方法處理過后一般就不必進(jìn)行這一步。
1． 將纖維素加到酸性緩沖液中。
2． 調(diào)整 pH 在4.5。有時(shí)甚至要用更高濃度的酸溶液來調(diào)節(jié)pH。
3． 在攪拌下抽真空（壓力降至10cmHg 以下）直到?jīng)]有更多的氣泡產(chǎn)生，在不產(chǎn)生沸騰之后停止真空。較合適的是在抽濾瓶中帶磁力攪拌器攪拌下進(jìn)行，抽濾瓶與吸氣器相連。
4． 加堿性緩沖液使得所希望的 pH。對(duì)要求更高的分離，所用緩沖液必須用除CO2 的水配制以保證無CO2。
采用含醇緩沖液
對(duì) SE53 型介質(zhì)需要含醇緩沖液，平衡時(shí)先用水緩沖液處理，然后再用含醇緩沖液系統(tǒng)完成平衡。
分批法離子交換
1． 將一定量的已預(yù)處理并平衡過無細(xì)粒的離子交換劑加到原溶液中。
2． 按原溶液中所含成分的容量攪動(dòng)一定時(shí)間進(jìn)行吸附分離。
3． 用過濾法或者離心法將離子交換劑和緩沖液分開。
4． 用平衡時(shí)所用緩沖液洗滌離子交換劑。
5． 在攪動(dòng)流化床下或離心下解吸，也可以將纖維素裝柱后用上述洗脫技術(shù)進(jìn)行解吸。
