NK細(xì)胞的制備方法，即通過聯(lián)合細(xì)胞因子和飼養(yǎng)細(xì)胞的刺激作用，提高NK細(xì)胞的增殖速度和純度。本發(fā)明的主要特點(diǎn)是：NCR3LG1和m?IL-15同時(shí)轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞，m?IL-15可以調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的活化和增殖，而NCR3LG1作為NK細(xì)胞表面主要的活化受體之一NKp30的配體，可以有效的刺激NK細(xì)胞活化，且兩者有協(xié)同作用。本發(fā)明提供出一種聯(lián)合飼養(yǎng)細(xì)胞和游離因子共同培養(yǎng)制備NK細(xì)胞的方法。

1.NK 細(xì)胞的制備：懸浮NK 于接種培養(yǎng)液中，細(xì)胞濃度調(diào)至106/ml。

2.培養(yǎng)基接種NK 細(xì)胞

　1）于4℃用300×g 離心飼養(yǎng)細(xì)胞12min。

　2）被離心的飼養(yǎng)細(xì)胞懸浮于飼養(yǎng)培養(yǎng)液中，細(xì)胞濃度調(diào)至2×106/ml。

　3）用強(qiáng)度5000radγ射線照射飼養(yǎng)細(xì)胞，于4℃用300×g 離心飼養(yǎng)細(xì)胞12min，將離心細(xì)胞再懸浮于飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)液中，飼養(yǎng)細(xì)胞濃度調(diào)至2×106/ml。

　4）在6 塊96 孔培養(yǎng)板的各孔中加100μl 上述飼養(yǎng)細(xì)胞懸液（總量用60ml 飼養(yǎng)細(xì)胞懸液，含1．2×108 個(gè)飼養(yǎng)細(xì)胞）。

　5）將96 孔板置37℃孵箱預(yù)溫，直到加入NK 細(xì)胞。

　6）將NK 細(xì)胞懸浮于接種培養(yǎng)基液中，并于預(yù)溫的96 孔板中加入100μlNK 細(xì)胞，使成為10 細(xì)胞/孔、5 細(xì)胞/孔和2．5 細(xì)胞/孔的三種類型板，而且每種類型重復(fù)二塊板。

　7）將培養(yǎng)板置5％CO2 孵箱中37℃培養(yǎng)。

3.NK 細(xì)胞的再刺激（接種后2－3 天，主要依賴于飼養(yǎng)細(xì)胞）

　1）從每孔中輕輕移棄100μl 上清液。

　2）每孔中加入含有經(jīng)照射的飼養(yǎng)細(xì)胞（2×106 細(xì)胞/ml）的NK 克隆培養(yǎng)液100。此培養(yǎng)液的制備方法如下：

　（1）融化飼養(yǎng)細(xì)胞，移至50ml 試管中。

　（2）輕輕地加入培養(yǎng)液30ml，混勻后用5000radγ射線照射飼養(yǎng)細(xì)胞。

?。?）用300×g 離心飼養(yǎng)細(xì)胞12min，并計(jì)數(shù)飼養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量。

?。?）按細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，將飼養(yǎng)細(xì)胞懸浮于NK 克隆培養(yǎng)液中，調(diào)至細(xì)胞濃度為2×106/ml。

4.換液（6－8 天）從每孔中輕輕移棄100μl 上清液，并加入新鮮NK 克隆培養(yǎng)液100μl。

5.檢測(cè)NK 細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況（9－10 天）如檢查有細(xì)胞生長(zhǎng)，按第8 天的操作換液。

6.分離克?。?1－15 天）

　1）當(dāng)培養(yǎng)基液顏色變黃時(shí)，證明細(xì)胞已生長(zhǎng)，在96 孔板上將生長(zhǎng)的NK 按1 孔分為2 孔，2 孔分為4 孔，4 孔分為8 孔的方式分離克隆培養(yǎng)。

　2）在96 孔板上擴(kuò)增克隆，并重復(fù)第7 天的操作。