腫瘤條件培養(yǎng)基制備：

1．取C3H小鼠的S-180實體肉瘤組織。

2．*消化，Dulbecco改良Eagle氏培養(yǎng)液15ml（含10％小牛血清），接種到T-75 Falcon產(chǎn)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

3．在細(xì)胞生長接近*匯合時，收集培養(yǎng)液制成條件培養(yǎng)基；再用含10％小牛血清的新培養(yǎng)液后，也每隔兩天收集一次，可獲得多量條件培養(yǎng)基。

4．4000轉(zhuǎn)/分離心后，再通過0.22μm微孔濾膜濾過，－20℃凍存?zhèn)溆茫ㄅR用前融解）。

初代培養(yǎng)：

1．取材：取新鮮牛腎上腺數(shù)個，先用Hanks液洗除血污。

2．剝除被膜，分離出皮質(zhì)，切成1立方毫米小塊，加0.5％膠原酶室溫中消化1小時，每隔10分鐘用吸管吹打懸液令消化充分。

3．通過不銹鋼紗網(wǎng)濾過，網(wǎng)眼要求只允許能通過小于110微米長的毛細(xì)血管小段。

4．650rpm，4℃，離心7分鐘后，棄掉上清膠原酶。

5．沉淀物用培養(yǎng)液重懸并離心，再重懸，再離心，共兩次。

6．末次沉淀物仍用含有10％小牛血清的Dulbecco改良Eagle氏培養(yǎng)液重懸后，稍吹打。

7．接種于鋪有明膠底層的培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)，在培養(yǎng)頭1～3小時中，毛細(xì)血管小段和內(nèi)皮細(xì)胞zui先帖附于底物上，而腎上腺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞卻仍在培養(yǎng)液中漂浮。

8．趁此時，吸除培養(yǎng)液，再加入腫瘤條件培養(yǎng)液，每兩天換液一次。毛細(xì)血管小段一般成自1～4個內(nèi)皮細(xì)胞，以后每個小段在底物上慢慢展成特殊形態(tài)的細(xì)胞島，能持續(xù)2～5天。

毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)：

1．初代培養(yǎng)2～3天后，鏡下確認(rèn)幾個毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞島，在培養(yǎng)皿背面，用不脫色筆劃圈圈起。

2．鏡下檢查，如圈內(nèi)殘有非內(nèi)皮細(xì)胞時，可用顯微細(xì)針在倒置顯微鏡下挑除。此操作用細(xì)胞解剖器或用手操作均可，宜在凈化臺無菌氣流中、打開培養(yǎng)皿蓋進行，但時間不宜過長（15～20分鐘），圈內(nèi)非內(nèi)皮細(xì)胞可用無菌膠刮除。

3．用培養(yǎng)液漂洗兩次，以去除漂浮細(xì)胞。

4．剩余內(nèi)皮細(xì)胞島如?。?～20個細(xì)胞）而少時，生長增值變得緩慢或不*不生長，此時需加入3T3等飼細(xì)胞，飼細(xì)胞接種量為4000細(xì)胞/cm2。

5．當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞充滿所有飼細(xì)胞空間后，用*消化、離心、加入腫瘤條件培養(yǎng)基。

6．接種入明膠底物皿中繼續(xù)培養(yǎng)（飼細(xì)胞死亡淘汰），細(xì)胞增殖生長匯合后，按1：5傳代。