PCR（Polymerase Chain Reaction）：又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其基本原理是酶促DNA合成反應(yīng)，即在模板DNA、因?yàn)楹兔撗鹾颂呛怂岽嬖谙拢谀蜔?/span>DNA聚合酶作用下，經(jīng)過(guò)DNA鏈熱變性、引物退火和引物延伸三個(gè)步驟，循環(huán)往復(fù)，使DNA片段在短時(shí)間內(nèi)迅速擴(kuò)增。它具有特異、敏感、高產(chǎn)率、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、自動(dòng)化等突出特點(diǎn)，在分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域迅速得到廣泛應(yīng)用。

PCR條件對(duì)反應(yīng)的七大影響有：

一、變性溫度與時(shí)間

模板變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA解鏈的溫度，達(dá)不到變性溫度就不會(huì)產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR也就不會(huì)啟動(dòng)。變性溫度低則變性不*，DNA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，從而減少產(chǎn)量。變性溫度太高，又會(huì)影響酶的活性。一般情況下可設(shè)為94℃ 20-30 s，高溫變性溫度不宜超過(guò)95℃。

二、退火溫度與時(shí)間

退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量。溫度高特異性強(qiáng)，但過(guò)高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴(kuò)增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過(guò)低可造成引物與模板錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物增加。合適的退火溫度一般在45-68℃之間。設(shè)置特定反應(yīng)的zui適退火溫度，可根據(jù)引物的（G+C）%含量進(jìn)行推測(cè)，一般實(shí)驗(yàn)中退火溫度比擴(kuò)增引物的熔解溫度Tm低5℃，退火時(shí)間一般為30-60 s，足以使引物與模板之間*結(jié)合。

三、引物

引物與模板錯(cuò)配對(duì)的長(zhǎng)度應(yīng)至少為17個(gè)核苷酸，zui高不宜超過(guò)30個(gè)核苷酸，zui*長(zhǎng)度為20-24個(gè)核苷酸，如需插入酶切位點(diǎn)，應(yīng)在酶切位點(diǎn)5’端加保護(hù)堿基，有利于酶切。引物的（G+C）%含量應(yīng)盡量相近。引物內(nèi)部應(yīng)避免形成明顯二級(jí)結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)。兩個(gè)引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)，特別是在引物3’端的延伸。人工合成的引物需經(jīng)色譜層析或PAGE純化以除去未能合成至全長(zhǎng)的短鏈雜質(zhì)。引物的終濃度一般為0.1-1μM，濃度太高會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，濃度太低則擴(kuò)增產(chǎn)物太少。

四、酶量

50μl反應(yīng)體系可用0.5-5U酶，酶量的選擇與模板DNA的量、擴(kuò)增片段大小等有關(guān)，酶量過(guò)多易發(fā)生非特異性反應(yīng)，而且可能增加突變機(jī)率，尤其在進(jìn)行高保真擴(kuò)增時(shí)，盡量減少酶量，但酶量過(guò)少時(shí)反應(yīng)性能會(huì)下降。

五、延伸溫度與時(shí)間

PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇70-75℃之間，延伸時(shí)間根據(jù)所選聚合酶擴(kuò)增速度和擴(kuò)增片段大小設(shè)定，如同樣擴(kuò)增2kb片段，使用Taq酶只需1min，使用高保真酶則需2min以上。延伸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，時(shí)間太短則可能得不到擴(kuò)增產(chǎn)物或得到一些短的非特異性片段。

六、循環(huán)次數(shù)

可根據(jù)模板的量，擴(kuò)增片段的大小和擴(kuò)增產(chǎn)物的下游應(yīng)用等因素，設(shè)定30-40個(gè)循環(huán)。循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足，如果循環(huán)次數(shù)太多，錯(cuò)配機(jī)率會(huì)增加，非特異性背景嚴(yán)重。所以在保證產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。

七、模板

模板可以是單鏈DNA也可以是雙鏈DNA，質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增效率略低于線狀DNA。模板加量一般不需太多，不超過(guò)1μg為宜，因?yàn)槟０辶窟^(guò)多可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加，但同時(shí)要考慮模板中靶序列的含量。