7-AAD Cell Cycle Analysis Kit細胞周期檢測試劑盒

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

7-AAD 細胞周期檢測試劑盒（7-AAD Cell Cycle Analysis Kit）是一款采用7-AAD染色法進行細胞周期檢測的試劑盒，通過流式細胞儀進行分析。本試劑盒通常用于貼壁細胞或懸浮細胞的細胞周期檢測。對于組織樣品，需經(jīng)消化成單細胞后才可用此試劑盒進行檢測。

7-氨基放線jun素D（7-Aminoactinomycin D,7-AAD）是一種不具有膜滲透性的DNA結合染料（選擇性插入DNA的GC富集區(qū)），通常被活細胞排除在外。活細胞和早期凋亡細胞排斥7-AAD不被染色，但具損傷質(zhì)膜或受損/無代謝活動的細胞無法阻擋染料進入而被染色。7-AAD/DNA復合物能被488nm的氬離子激發(fā)器，發(fā)生大的斯托克斯遷移，發(fā)射波長在647nm。細胞經(jīng)7-AAD染色后，假設G0/G1期細胞的熒光強度為1，那么，含雙份基因組DNA的G2/M期細胞的熒光強度理論值為2，正在進行DNA復制的S期細胞的熒光強度介于1-2（見附圖I）。

產(chǎn)品組成

保存與運輸方法

保存：染色緩沖液+4℃保存，7-AAD染色液+4℃避光保存，RNase A-20℃保存，一年有效。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1） 因7-AAD也能結合RNA，因此，試劑盒內(nèi)提供RNase A用來降解RNA，以降低背景熒光。然而，雖有資料顯示，7-AAD不和RNA結合，但從我司的實驗數(shù)據(jù)來看，添加RNase處理的效果更好。

2） 因7-AAD不具有細胞膜滲透性，則需先對細胞進行乙醇固定，再進行后續(xù)染色。

3） 請自行準備95%乙醇和PBS。

4） 熒光染料均存在熒光淬滅，保存和使用過程中請注意避光，以減緩淬滅。

5） 因7-AAD對人體有刺激性，請注意適當防護。

6） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、 染色步驟

1.1 細胞樣品的準備：每個樣品的細胞數(shù)量可以為500萬以上。

a）對于貼壁細胞：小心收集細胞培養(yǎng)液到一干凈離心管內(nèi)備用。用胰mei消化細胞，直至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000rpm離心3-5min，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果無法完quan離心至管底，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心速度。小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細胞。加入約1ml 冰浴預冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清。再次加入1ml冰浴預冷的PBS，重懸細胞。

b）對于懸浮細胞：1000rpm離心5min沉淀細胞。對于特定的細胞，如果無法完quan離心至管底，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心速度。小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細胞。加入1ml 冰浴預冷的PBS，重懸細胞，并轉移到1.5ml離心管內(nèi)。再次離心沉淀細胞，小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的PBS，以避免吸走細胞。再次加入1ml冰浴預冷的PBS，重懸細胞。

c）對于組織樣本：用剪刀將組織剪成盡量小的小塊后，用0.25%胰mei消化30-60min（或根據(jù)實際情況選擇適當?shù)幕旌厦竵磉M行組織消化），經(jīng)過200-400目細胞篩網(wǎng)過濾得到單細胞懸液。然后參照步驟b）對于懸浮細胞來準備樣品。

1.2 細胞固定：取4ml冰浴預冷的95%乙醇，一邊低速渦旋震蕩的同時逐滴加入1ml細胞懸液（冰上操作），混勻后于4℃固定2h或更長時間，固定12~24h可能效果更佳。1500rpm離心5min沉淀細胞。對于特定的細胞，如果無法完quan離心至管底，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心速度。小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的乙醇固定液，以避免吸走細胞。加入約5ml冰浴預冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清，可以殘留約50µl左右的PBS，以避免吸走細胞。輕輕彈動離心管底以分散細胞避免細胞成團。

1.3 7-AAD染色工作液的配制：參照下表根據(jù)實際檢測樣本的數(shù)量配制足量的7-AAD染色工作液【注意：7-AAD染色工作液短時間可4℃保存，但需當日使用】。

1.4 染色：每管細胞樣品中加入0.1ml 7-AAD染色工作液，緩慢并充分重懸細胞沉淀，37℃避光孵育30min。隨后可置于4℃或冰浴避光存放。

1.5 加入2ml PBS，1500rpm離心5min，去上清。

1.6 加入500μl PBS，流式細胞儀上機檢測。【請在24h內(nèi)完成流式檢測，能在當天完成流式檢測?！?/p>

1.7 流式檢測與分析：用流式細胞儀在激發(fā)波長488nm處檢測紅色熒光（7-AAD通道或PerCP通道），同時檢測光散射情況。采用適當分析軟件進行DNA含量和光散射分析。

【注意】：j上機時，熒光通道設置為線性放大（Linear Scale）；k數(shù)據(jù)分析，去除粘連細胞。

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附圖I.典型的7-AAD細胞周期示例圖（參考用）

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

上海懋康生物科技有限公司是一家涉足于生命科學和生物技術領域研究的試劑、儀器和實驗室消耗品與實驗服務工作，主要從事細胞生物學、植物學、分子生物學、免疫學、生物化學、蛋白組學。生物制藥與診斷試劑研發(fā)生產(chǎn)等領域。 本公司秉承“以人為本，以誠為信、合同守信"的經(jīng)營理念。堅持"品質(zhì)保障"的原則為廣大客戶提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品。

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