深圳子科生物報道：

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)作為新一代基因組編輯技術(shù)，為生命科學(xué)的研究提供了革命性的工具，為生物技術(shù)在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用迎來了新機(jī)遇。但是在很多真核生物中，由于缺乏向?qū)?RNA 表達(dá)方法，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的建立和應(yīng)用受到很大制約。黑曲霉是一種重要的工業(yè)微生物，其產(chǎn)品檸檬酸、酶制劑等在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域用途廣泛，然而目前仍然無法實(shí)現(xiàn)對黑曲霉的基因組編輯，限制了其工程應(yīng)用潛力的發(fā)揮。

近日，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究員孫際賓帶領(lǐng)的系統(tǒng)生物學(xué)中心與研究員鄭平帶領(lǐng)的系統(tǒng)與合成生物技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)合作，在重要工業(yè)微生物黑曲霉中提出以核糖體 5S rRNA 基因?yàn)閱幼咏閷?dǎo) sgRNA 的表達(dá)，開發(fā)了一種基于 5S rRNA 的新型的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，使 Cas9 對黑曲霉基因組定點(diǎn)切割效率可達(dá) 100%。以此建立了黑曲霉基因組編輯工具包，以 40 bp 的短同源臂供體 DNA 可以簡便地實(shí)現(xiàn)單位點(diǎn)、多位點(diǎn)的基因敲入以及長至 48 kb 的大片段 DNA 敲除等基因組編輯。該新型 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)有效解決了黑曲霉 sgRNA 的活性表達(dá)問題，突破了黑曲霉基因組編輯的瓶頸，為認(rèn)識黑曲霉工業(yè)潛力的生物學(xué)分子基礎(chǔ)，進(jìn)一步提升其工業(yè)應(yīng)用性能，開發(fā)新型細(xì)胞工廠和新產(chǎn)品提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。同時，由于核糖體 5S rRNA 的高度保守性，在任意生物中都可以快速找到其 5S rRNA 基因，基于 5S rRNA 的向?qū)?RNA 表達(dá)策略的提出，為解決真核生物向?qū)?RNA 表達(dá)難題、實(shí)現(xiàn) CRISPR/Cas9 基因組編輯系統(tǒng)在各種真核生物的建立和應(yīng)用開辟了普適性的新思路。

該研究得到國家自然科學(xué)基金青年與面上項(xiàng)目以及中科院人才計(jì)劃等項(xiàng)目的支持，相關(guān)研究成果已發(fā)表在期刊 ACS Synthetic Biology 上。天津工生所助理研究員鄭小梅為論文的*作者。

圖 1 應(yīng)用不同的 guide RNA 表達(dá)策略的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)黑曲霉 albA 基因失活。（A）CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)的 albA 基因失活的基因組編輯過程示意圖；（B）5S rRNA 基因啟動 guide RNA 表達(dá)的核心序列鑒定；（C）不同啟動子策略對 albA 基因失活效率的影響。

圖 2 基于 5S rRNA 的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)的黑曲霉基因組編輯效率

圖 3 基于 5S rRNA 的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)黑曲霉基因組編輯的實(shí)驗(yàn)流程示例