轉(zhuǎn)膜是把DNA 從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物(一般是尼龍膜)上固定，是進(jìn)行各種后續(xù)研究(如 RFLP 分析，陽(yáng)性克隆的篩選驗(yàn)證等所有涉及分子雜交的研究)的前提。

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

掌握 Southern Blotting 的原理及操作步驟

實(shí)驗(yàn)原理：

1.轉(zhuǎn)膜的方式：

向上的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移

向下的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移

同時(shí)向兩張膜轉(zhuǎn)移

電轉(zhuǎn)移

真空轉(zhuǎn)移

2.固相支持物的種類(lèi)及選擇：

硝酸纖維素膜：非共價(jià)結(jié)合，易脆，易丟失DNA ， < 500 bp 的DNA 無(wú)效，轉(zhuǎn)膜前的工作(從提高轉(zhuǎn)膜效率，利于轉(zhuǎn)膜后使用等)。

尼龍膜(帶正電荷的)高強(qiáng)度，不易破損，具有較大的DNA 結(jié)合容量，它能夠吸附變性DNA ，核酸以共價(jià)結(jié)合方式不可逆的結(jié)合在尼龍膜上。尼龍膜兩邊均有吸附DNA 的功能，無(wú)論用哪邊均可以經(jīng)久耐用，可反復(fù)利用 10 次以上( 10-20 次)，經(jīng)毛細(xì)管(毛細(xì)吸附)作用，把DNA 從凝膠上轉(zhuǎn)到膜上。DNA 轉(zhuǎn)到膜上是復(fù)制膠上的帶型，在 80-100 ℃真空干燥 2-4 hrs ，即可固定DNA 。

3.轉(zhuǎn)移緩沖液( transfer buffer )的選擇：

帶正電荷的尼龍膜：可用高鹽離子強(qiáng)度( SSC )，但不能充分發(fā)揮膜潛能; 0.4N NaOH ，共價(jià)結(jié)合DNA 是zui大優(yōu)點(diǎn)。

硝酸纖維膜：高鹽離子強(qiáng)度促進(jìn)DNA 與膜結(jié)合( 20 × SSC )，低鹽離子強(qiáng)度導(dǎo)致小片段DNA 在轉(zhuǎn)移過(guò)程中丟失， pH>9 ，DNA 不能與膜結(jié)合。

4.轉(zhuǎn)膜時(shí)間( duration of transfer )約 12 hrs。

取決于毛細(xì)管系統(tǒng)，DNA 大小，膠厚度 (<5 mm) 及濃度 (<1%) 。

DNA 分子量大小決定時(shí)間長(zhǎng)短，部分去嘌呤減小DNA ，堿轉(zhuǎn)移 2hrs 大部分結(jié)合到膜。

DNA 轉(zhuǎn)移的效率較難判斷，只有在轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，通過(guò) EB 染膠，及分子雜交才可以鑒別效率高低，但已無(wú)補(bǔ)救措施，因此，每一步應(yīng)嚴(yán)格操作。

實(shí)驗(yàn)材料及試劑： 酶消化好的DNA 樣品，尼龍膜， 0.2NHCl ， 0.4N NaOH 等。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.0.8% 瓊脂糖電泳。

制膠：注意瓊脂糖的質(zhì)量，膠的濃度，厚度(<5mm)及均一性。一般大電泳槽配制 250ml 0.8% 瓊脂糖凝膠，采用 42 孔梳子(經(jīng)濟(jì)，)。

制樣，點(diǎn)樣：DNA 樣品中指示劑量稍多。

電泳：一般 1-1.5V/cm 的電壓，使DNA 遷移到適當(dāng)距離，一般指示劑約移動(dòng) 10-11cm ( 大電泳槽： 40V × 12-15hrs ，小電泳槽 30V × 4-5 hrs)。

2.轉(zhuǎn)膜前的準(zhǔn)備：

依膠大小每塊凝膠準(zhǔn)備兩張比膠稍大的濾紙( 11 × 12.5 cm )，兩張用作鹽橋的濾紙，一張與膠同樣大小的尼龍膜( 10 × 10.5cm )，兩個(gè)玻璃盤(pán)、兩塊有機(jī)玻璃板、一根玻璃棒，比尼龍膜稍大的一疊吸水紙等。

3.一玻璃盤(pán)中加入足量的 0.4N NaOH ，放上洗凈的玻璃板，按圖示搭制鹽橋 ( 操作示范 ) 。

4.凝膠的預(yù)處理：

a.從電泳槽中移出凝膠置于塑料板上，用切膠板把膠切成適當(dāng)大小，切去右上角(zui后一個(gè)樣品的zui前端)作為電泳方向記號(hào)。

b.把凝膠翻面，放入加有足量 0.2N HCl 的玻璃盤(pán)中，輕輕搖動(dòng) 10min ，使指示劑變黃色為止(脫嘌呤)。

c.倒去 HCl 溶液，加蒸餾水漂洗凝膠。

d.倒去蒸餾水，加 0.4N NaOH 中和。

e.同時(shí)在鹽橋?yàn)V紙上灑些 0.4 NaOH ，立即將膠放在鹽橋上(忌氣泡)。

5.膠的四周用塑料片與膠緊緊相連，防止短路(吸水紙與鹽橋相接)。

6.在膠面上倒足夠量 0.4N NaOH ，小心放置膜(預(yù)濕 0.4N NaOH )使膜覆蓋整塊膠(要求一次成功，不能移動(dòng))。

7.膜上放 2 張濾紙，濾紙大小為 15 × 12cm。

8.放不少于 5cm 厚的吸水紙，放上玻板，其上壓約 500g 的重物，轉(zhuǎn)膜 12 hrs 左右。

9.轉(zhuǎn)膜完畢，用 2 × SSC 漂洗膜兩次，各 5min 。用 EB 染膠以檢測(cè)轉(zhuǎn)移效果。

10.用兩張濾紙包住膜，置于 80-100 ℃的真空干燥箱中，干燥 2-4 hrs 。

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