hanks液可以維系細(xì)胞正常滲透壓與pH，本文主要記錄了動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中Hanks液、D-Hanks液和消化液(胰酶液)的配制方法及其注意事項(xiàng)。

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng): hanks、D-Hanks液和消化液(胰酶液)的配制

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模菏炀氄莆誋anks、D-Hanks液等平衡鹽溶液的配制，了解消化液(胰酶液)的配制方法。

實(shí)驗(yàn)原理：Hanks液是常見的平衡鹽溶液(BSS)之一。D-Hanks液則是無鈣鎂離子的Hanks液。BSS與細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)下的pH值、滲透壓及無菌狀態(tài)一致，且配方簡(jiǎn)單，是組織培養(yǎng)基本用液，常用于配制培養(yǎng)基及其他用液，或洗細(xì)胞等，細(xì)胞在BSS中可生存幾個(gè)小時(shí)。 胰蛋白酶(胰酸)溶液是一種常用的細(xì)胞消化液，原代培養(yǎng)時(shí)用于處理組織塊，使細(xì)胞分離下來。傳代時(shí)用胰蛋白酶使培養(yǎng)細(xì)胞離開所貼附的培養(yǎng)瓶表面，并分散成單個(gè)細(xì)胞。胰蛋白酶主要采自?；蜇i的胰臟，呈白色粉末狀，易潮解，應(yīng)在低溫干燥處保存。胰酶的活力常用一份胰酶解離酪蛋白的份數(shù)表示，常用胰酶活力為1：125或1：250。本實(shí)驗(yàn)室一般用1：250(GRC公司生產(chǎn))。胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的分離效果與細(xì)胞的類型、特性和瓶壁表面特性有關(guān)。一般來說濃度大、溫度高(勿高于37℃)、作用時(shí)間長(zhǎng)，則對(duì)細(xì)胞分離能力大。但超過一定程度會(huì)損傷細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞傳代后不能貼壁或死亡。胰酶在pH 8.0、37℃時(shí)消化能力zui強(qiáng)。溶液中的Ca2+、Mg2+和血清會(huì)降低胰酶活力，所以配制胰酶時(shí)須用無Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。當(dāng)消化結(jié)束時(shí)，可加入少量血清或含血清的培養(yǎng)基以終止胰酶作用。 細(xì)胞傳代使用的胰酶濃度是0.25%或0.2%。用于原代細(xì)胞培養(yǎng)消化組織塊則為0.1%或0.125%。

實(shí)驗(yàn)材料與用品

***材料：3 000 mL錐形瓶，25 mL、50 mL試劑瓶，500 mL輸液瓶，螺口蓋，翻帽塞，pH試紙，孔徑0.22μm的微孔濾膜。

***藥品：NaCl，Na2HP04，KH2P04，KCl，酚紅，NaHC03，胰蛋白酶干粉，0.02%EDTA，CaCl2，D-葡萄糖，MgCh·6H20，MgS04·7H20，酚紅(0.1%)(配法：稱酚紅2 g，置于研磨器中，先用數(shù)滴5.6%的NaHCO3溶液溶解并研磨，再加進(jìn)該5.6%NaHC03溶液使zui終體積為100 mL。瓶裝保存，備用)。

***儀器(請(qǐng)參看儀器圖庫)： 抽濾泵1套，過濾器1套，高壓滅菌鍋，量筒，磁力攪拌器，研磨器。

實(shí)驗(yàn)步驟

(一)配制D-Hanks液

1.按表2—3—5稱取D-Hanks試劑。

2.依次加入上述試劑至800 mL蒸餾水中，溶解后定容至1 1000 mL。 3.高壓滅菌，10磅10 min。
(二)配制Hanks液

1.按表2—3—5稱取Hanks試劑。

2.配制Hanks時(shí)，需將CaCl2另溶解于100 mL的蒸餾水中。

3.依次加入上述試劑至700 mL蒸溜水中，溶解后再與CaCl2溶液一起定容至1 000 mL。

4.10磅，10 min高壓滅菌。

(三)配制胰蛋白酶消化液

1.D.Hanks液高壓滅菌之后，晾至室溫，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.稱取一定量胰蛋白酶粉末于研磨器中(夏天時(shí)研磨器應(yīng)放在冰浴中)，加入少量D-Hanks液研磨1 000次左右，調(diào)制成糊狀。再放入4℃預(yù)冷的適量D-Hanks液中，4℃下磁力攪拌使*溶解。

3.用NaHC03干粉將胰酶溶液的pH值調(diào)至8.0左右(胰酶作用的zui適pH值)，并加入0.02%EDTA以協(xié)助消化作用。

4.濾過除菌(方法見二、培養(yǎng)基的配制)，-20℃凍存。

注意事項(xiàng)：

1.BSS的pH值應(yīng)確定為7.2左右。

2.如配制的Hanks液高壓滅菌后液體變混，則可將100 mL的CaCl2與含有其他成分的液體分別裝瓶高壓滅菌之后，再在無菌條件下配制，定容。這樣可以避免高壓滅菌后液體變混。

3.胰酶受熱易失活，所以盡量避免盛夏配制，并且在配制過程中溫度應(yīng)始終保持在4℃左右。

4.胰酶研磨要充分，否則在過濾時(shí)會(huì)將較大的顆粒過濾掉，不能達(dá)到真正的濃度。

5.胰酶分裝時(shí)盡量分裝成多瓶，并遵守3次左右用完和只裝2/3體積的原則。因?yàn)槔鋬霰４鏁r(shí)體積會(huì)膨脹，而多次使用同一瓶胰酶反復(fù)凍融會(huì)降低消化效果并可能造成污染。

D-hanks液和hanks液間區(qū)別是hanks液中含有MgCl2 、MgSO4 、CaCl2和葡萄糖，而D-hanks中不含有這些，D-hanks液主要用于消化液等，Ca/Mg離子可以降低消化液中胰蛋白酶的活性，嚴(yán)重影響消化的效果。所以只有D-hanks液用于消化液。

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