一、材料和試劑

1、玻片：須用免疫組化玻片，或用2%多聚賴氨酸包被處理玻片。

2、5-10%正常山羊血清封閉液，用PBS配。

3、3%牛血清白蛋白(BSA)，用PBS配。

4、0.01M pH7.4 PBS

5、1% BSA-PBS(含0.05% Tween20)

6、AEC底物

(1)底物緩沖液(20X) PH 4.6

醋酸(分子量60.6) 30.6ml

Triton X-100

醋酸鈉 3H2O(分子量136.1)66.68克

加蒸餾水到960ml，調(diào)pH到4.6，zui后加蒸餾水到總體積1000ml。

(2)AEC(20X)

AEC 15mg/ml，溶在DMF(二甲基甲酰胺，分子式HCOH(CH3)2 分子量73.10中)

(3)0.6% H2O2(20X)

臨用時，(1)(2)(3)各50ul，在1ml雙蒸餾水中混勻30分鐘內(nèi)有效。

7、DAB(即DAB-4HCL)

(1)1.5克DAB在100ml水溶液中(20X)

(2)1M Tris(20X)，用HCl調(diào)PH到7.4

(1)(2)(3)各滴加入1ml二蒸水中，新鮮配，避光，30分鐘內(nèi)有效。溶解后(可加熱到50℃)，加水合氯醛50克(水合氯醛Chloral Hyclrate，分子量165.4)，枸櫞酸1克，充分溶解，于棕色瓶中，室溫或400C保存。

8、蘇木素復(fù)染液

蘇木素 1克

碘酸鈉 0.2克

鉀礬 50克

水 1000ml

9、含10%及2%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液。

10、3% H2O2：30%H2O21份，加9份雙蒸水，臨用時配。

11、細胞抗原玻片及96孔細胞抗原板

12、封片液：1克明膠，溶于30ml 35℃水中，加入35ml甘油(或用甘油封片)和650mg石碳酸(先溶于0.6ml水中)。

二、細胞內(nèi)源過氧化物酶阻斷(使用HRP標(biāo)記二抗或SP法時必須阻斷)

1、從冰箱取出細胞片或細胞板，置室溫或37℃ 10-15分鐘，使恢復(fù)溫度。

2、加3% H2O2，細胞片20ul/孔，培養(yǎng)板100ul/孔，使充分覆蓋住細胞。

3、室溫10分鐘后，甩掉 H2O2，用PBS輕輕淋洗2分鐘。用濾紙吸干細胞周圍水份，96孔在濾水紙上扣干，但注意保持細胞濕潤。

三、封閉

細胞片用5-10%正常山羊血清(20ml/孔)，細胞板用2-5%BSA(PBS配制)100ul/孔，置37℃孵育30分鐘后甩掉封閉液，不洗。

四、免疫化學(xué)染色

1、分別加一抗和所有對照一抗，細胞法10-20ul/孔，細胞板50ul/孔，使充分覆蓋細胞。37℃1小時或4℃冰箱過夜;

2、棄去一抗，如為細胞涂片用PBST輕輕簡單淋洗1次后，浸于100 mL含PBST洗杯，漂洗(在慢速搖床上)3-5分鐘，轉(zhuǎn)入第二杯PBS(100 ml)，如上法漂洗3-5分鐘。擦干細胞片周圍水分，96孔板則倒掉一抗后，每孔加滿PBST在搖床上搖洗3-5分鐘后倒掉，在濾紙上扣干，但保持細胞濕潤，反復(fù)3-4次;

3、加SP試劑(SP法，即放大)

(1)加已優(yōu)選好的濃度的Biotin標(biāo)記二抗，細胞片10ul/孔，細胞板50ul/孔，使充分復(fù)蓋細胞。37℃孵育30分鐘;

(2)按免疫化學(xué)染色“2”所述方法洗滌和擦干;

(3)加已優(yōu)選好濃度的SP試劑，用量同“(1)”，37℃孵育30分鐘后按免疫化學(xué)染色“2”法洗滌及擦干;

4、間接法加二抗(不放大)

方法同SP法，但不用Biotin標(biāo)記二抗，而改用HRP直接標(biāo)記二抗。并省略(3)步驟;

5、加底物顯色

(1)加足量的AEC顯色液，充分覆蓋細胞層，細胞玻片20ul/孔，細胞培養(yǎng)板50ul/孔，置于37℃恒溫箱孵育5-10分鐘，一般在顯微鏡下根據(jù)結(jié)果顏色的呈現(xiàn)情況掌握染色時間，以得到滿意的結(jié)果(陽性對照顯色程度為“+++” )，用自來水即可終止反應(yīng);

(2)復(fù)染：蘇木素染液(使用時間不超過兩個月)加蘇木素復(fù)染液1-2滴，1分鐘左右，在自來水下輕輕沖洗掉蘇木素，再浸于PBS中約30秒鐘返藍，zui后在蒸餾水中漂洗。

6、封片

洗后細胞片擦去周圍水分，滴加1滴甘油—明膠封片液，加蓋玻片，除去氣泡，用指甲油或樹膠封固玻片。

五、結(jié)果判斷

陽性——誘導(dǎo)細胞有10%-30%顯紅色，強度不一，未誘導(dǎo)陽性細胞(1-30%);陰性——誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)BCBL-1細胞*不顯色(排除邊緣效應(yīng))

六、注意事項

1、一抗、二抗的稀釋采用1% BSA/PBS，Sterptavidin-HRP的稀釋采用PBS;

2、整個反應(yīng)過程在濕盒中進行(細胞片);

3、洗滌時應(yīng)使用染色缸(細胞片);

4、對照系統(tǒng)，必須要做的對照系統(tǒng)：陽性對照：標(biāo)準(zhǔn)一抗，陽性血清，陽性上清;陰性對照：(1)陰性一抗對照：小鼠免疫前血清、測上清時用原克隆上清液;(2)陰性抗原細胞對照：未感染病毒的細胞，每個待測及對照均須做陰性細胞對照：空白對照：不加一抗，用1%BSA替代;無關(guān)對照：與本項目無的*抗體。

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