1)購(gòu)買的限制性內(nèi)切酶帶有兩種不同的酶切緩沖液，該用哪一種?

每種限制性內(nèi)切酶帶有一管酶的zui適反應(yīng)液(通常是一種4-CORE反應(yīng)液)，可能還帶有一只MULTI-CORE反應(yīng)液。

2)4-CORE酶切緩沖液體系是什么?

大多數(shù)(大約75%)Promega公司的限制性內(nèi)切酶有一種zui適酶切緩沖液，即4-CORE酶切緩沖液，分別叫作A、B、C和D。其余的25%的限制性內(nèi)切酶帶有一種特定的酶切緩沖液(酶切緩沖液E-L)。每一種限制性內(nèi)切酶帶有一只zui適酶切緩沖液。

3)MULTI--CORE酶切緩沖液體系是什么?

MULTI--CORE酶切緩沖液適用于雙酶切。每一種Promega公司的限制性內(nèi)切酶都測(cè)試了在MULTI--CORE酶切緩沖液中的活力，如果酶切活力達(dá)25%，就提供一只MULTI--CORE酶切緩沖液。作雙酶切時(shí)，如果兩個(gè)酶在MULTI--CORE酶切緩沖液中的活力達(dá)到50-100%，就可替代A-L酶切緩沖液。應(yīng)選用酶活力zui高的酶切緩沖液。

4)如何保存限制性內(nèi)切酶?

不太常用的限制性內(nèi)切酶多保存在-70oC,每周或每天用的酶保存在-20 oC。有一些酶需要不同的保存條件。每一種Promega公司的限制性內(nèi)切酶都提供一份分析說(shuō)明以供查訊。使用限制性內(nèi)切酶時(shí)，應(yīng)將酶保存在冰上。

5)一般的限制性內(nèi)切酶反應(yīng)中(也叫消化)，應(yīng)用多少內(nèi)切酶?

所用的酶量取決于DNA的純度、量和型態(tài)。限制性內(nèi)切酶的活力單位定義為在適當(dāng)?shù)臏囟认拢?小時(shí)內(nèi)，1ugDNA在50ul體積中，被*消化所需的限制性內(nèi)切酶的量。一般說(shuō)來(lái)，線性DNA比超螺旋DNA更易消化。比如，酶切1uglambdaDNA，需要1-2單位的酶，而酶切1ug質(zhì)粒dna，需要3-5單位的酶。

6)使用限制性內(nèi)切酶的一般步驟是什么?

一般步驟如下：

A)測(cè)試酶切DNA的量

B)計(jì)算*酶切所需的酶量。為使終體積中甘油的濃度低于8%，計(jì)算能加的酶量，zui多能加終體積的10%(甘油的濃度為5%)。

C)10X反應(yīng)液的體積應(yīng)為終體積的1/10;10X反應(yīng)液的體積不應(yīng)小于酶的體積。

D)加入計(jì)算好的DNA，10X反應(yīng)液，酶。

加入水到終體積(20-50 ul)，輕輕混勻，在適當(dāng)?shù)臏囟认卤?。一般酶的zui適溫度為37 oC，但有例外。應(yīng)查訊分析說(shuō)明。

比如：

質(zhì)粒DNA (2ug/ ul) 5 ul

10X反應(yīng)液 5 ul

酶(5ug/ ul) 5 ul

dH2O 35 ul

50 ul

37 oC保溫2-3小時(shí)。

應(yīng)zui后加酶。

7)一次使用兩個(gè)限制性內(nèi)切酶的一般步驟是什么(比如雙酶切)?

一次使用兩個(gè)限制性內(nèi)切酶的一般步驟，如同使用一個(gè)限制性內(nèi)切酶的一般步驟。但要注意兩個(gè)限制性內(nèi)切酶在同一種緩沖液中都要有活力。甘油的濃度不應(yīng)超過(guò)終體積的8%。應(yīng)注意有些酶對(duì)末端敏感，活力差。

8)能否在一次反應(yīng)中用很多的限制性內(nèi)切酶?

可以，一般而言，甘油濃度超過(guò)8%對(duì)酶切有抑制。有些酶在高的甘油濃度中會(huì)產(chǎn)生星活力。限制性內(nèi)切酶提供在50%的甘油中，故10 ul反應(yīng)體積中不應(yīng)加入超過(guò)1.6 ul的酶。

9)消化反應(yīng)中是否需要加牛血清白蛋白(BSA)?

不需要。酶切不需要加BSA。但Promega公司的限制性內(nèi)切酶活力測(cè)定時(shí)，均加入乙?；腂SA達(dá)0.1mg/ml。BSA可以提高許多限制性內(nèi)切酶活力。Promega公司的限制性內(nèi)切酶均提供一管乙酰化的BSA(R396D，E，F(xiàn))，并建議酶切時(shí)加入BSA達(dá)0.1mg/ml。

10)星活力是什么?

星活力是指在保溫條件改變，如NaCl過(guò)多存在于反應(yīng)液中，使酶切的核酸序列不同于它特定的識(shí)別序列。

11)什么是同切酶?

同切酶指兩個(gè)酶的識(shí)別位點(diǎn)和酶切位點(diǎn)相同，如SphI(CGTAC'G)和BbuI(CGTAC'G)互為同切酶。

12)什么是neoschizomer?

Neoschizomer指兩個(gè)酶的識(shí)別序列相同，但酶切位點(diǎn)不同，如SmaI(GGG'CCC)和XmaI(G'GGCCC)互為neoschizomer。

13)基因組規(guī)格指的是什么?

基因組規(guī)格的酶適用于酶切包裹在瓊脂中的基因組DNA。另外，染色體DNA的制備、酶切和凝膠分離的條件對(duì)基因組規(guī)格的酶作了優(yōu)化。

14)如果一個(gè)限制性內(nèi)切酶不是基因組規(guī)格，是否表明它不能用于處理染色體DNA?

不一定。如果一個(gè)限制性內(nèi)切酶不是基因組規(guī)格,Promega公司沒有測(cè)試它能否處理包裹的基因組DNA。因此需作一些測(cè)試來(lái)決定酶是否會(huì)切割底物。

15)需要用多少單位的限制性內(nèi)切酶對(duì)瓊脂包裹的染色體DNA進(jìn)行酶切?

切割包裹的DNA比普通底物需要更多的酶，一般需要多2倍。

16)什么是藍(lán)/白克隆測(cè)試?

藍(lán)/白克隆測(cè)試是一種確定酶切樣品中，存在的少量外切核酸酶活力的質(zhì)量檢查過(guò)程。通過(guò)測(cè)定一個(gè)功能基因(Beta-半乳糖苷酶)酶切和重新連接后，藍(lán)/白斑的比例，來(lái)確定外切核酸酶活力。如果存在少量外切核酸酶活力，或不存在外切核酸酶活力，得到的是藍(lán)色菌落。產(chǎn)生粘性末端的酶實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的白色菌落應(yīng)小于2%，而產(chǎn)生平頭末端的酶實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的白色菌落應(yīng)小于5%。這個(gè)方法的靈敏度很高，可以檢測(cè)出缺失一個(gè)堿基的酶切末端。

17)限制性內(nèi)切酶是如何命名的?

限制性內(nèi)切酶命名的次序如下：

A) 用3個(gè)字母代表來(lái)源的生物(如Bam代表 Bacillus amyloliquefaciens)

B) 1個(gè)字母或阿拉伯?dāng)?shù)字代表菌株(BamH)

C) 1個(gè)羅馬字母代表發(fā)現(xiàn)或鑒定的次序(BamHI)

18)如何稀釋限制性內(nèi)切酶?

如果1小時(shí)內(nèi)會(huì)使用限制性內(nèi)切酶，可用補(bǔ)充有0.5mg/ml BSA的1X反應(yīng)液稀釋，如果在更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)才會(huì)使用限制性內(nèi)切酶，用酶貯存液稀釋。

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