試想一下，若沒(méi)有各種方法來(lái)分離組成細(xì)胞的不同區(qū)室和組分，那么現(xiàn)代生物學(xué)將困難重重。從細(xì)胞信號(hào)通路到新陳代謝，人們一直想知道，它們?cè)谀膬?，過(guò)去、現(xiàn)在及將來(lái)。

市場(chǎng)部Monica O’Hara Noonan介紹，研究人員對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分級(jí)分離(fractionate)的原因有很多。他們可能希望，當(dāng)感興趣的蛋白在某些條件下或某種處理之后轉(zhuǎn)位時(shí)，對(duì)其進(jìn)行追蹤。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分級(jí)分離能增強(qiáng)低豐度蛋白的檢測(cè)能力，或降低下游分析或功能分析的復(fù)雜性。

如果您正在從事這一方面的研究，請(qǐng)繼續(xù)往下讀。從細(xì)胞上講，我們會(huì)幫助您將小麥和谷殼分開(kāi)。

細(xì)胞的組分

如何對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分級(jí)分離取決于很多因素，包括哪些儀器、知識(shí)可以利用，您想要分離什么，以及這些組分的下游應(yīng)用是什么。

離心是細(xì)胞分級(jí)分離中zui常用的技術(shù)之一，它們單獨(dú)使用，或與其他方法結(jié)合。例如，對(duì)于高爾基體或過(guò)氧化物酶體，大部分操作都要求高速的密度梯度離心。然而，O’Hara Noonan也指出，超速離心也有一些缺點(diǎn)，包括超速離心機(jī)是高價(jià)的儀器，有些實(shí)驗(yàn)室無(wú)法接觸到。另外，密度梯度難以?xún)A倒是出了名的，其結(jié)果是技術(shù)依賴(lài)的。

當(dāng)然，其他的許多組分也可以只利用試劑和臺(tái)式儀器來(lái)富集。供應(yīng)商開(kāi)發(fā)出一些試劑盒，能方便快捷地帶來(lái)高度富集的細(xì)胞組分。Mem-PER Plus試劑盒，能在一小時(shí)之內(nèi)富集完整的膜相關(guān)蛋白。

據(jù)sigma-aldrich的產(chǎn)品專(zhuān)家Michael Moehlenbrock介紹，這類(lèi)試劑盒的原理在很大程度上是類(lèi)似的。它們往往使用低滲緩沖液給細(xì)胞膜帶來(lái)壓力，然后用等滲的提取緩沖液(帶或不帶還原劑和蛋白酶抑制劑)來(lái)維持感興趣的細(xì)胞器。有時(shí)也需要機(jī)械裂解或去污劑裂解。“各個(gè)不同供應(yīng)商在細(xì)胞分級(jí)分離試劑盒的設(shè)計(jì)上都是一致的，而不同細(xì)胞組分的差異在于緩沖液組成、裂解試劑和離心速度，”Moehlenbrock說(shuō)。

此類(lèi)試劑盒的價(jià)值并不在于某些秘密試劑，而在于QC系統(tǒng)的一致性和重復(fù)性。“細(xì)胞分級(jí)分離的方法已經(jīng)過(guò)充分鑒定，其操作步驟適用于大部分應(yīng)用，”Moehlenbrock說(shuō)。“商業(yè)化試劑盒為zui終用戶(hù)帶來(lái)了簡(jiǎn)便和效率，同時(shí)提供了*的安全性。”

通過(guò)改變穿插在離心步驟之間的緩沖液的去污劑組分，研究人員可分離不止一個(gè)組分。例如，市場(chǎng)上許多試劑盒可收集細(xì)胞核和胞漿蛋白。其他試劑盒也帶來(lái)了三個(gè)或四個(gè)不同的組分。Cell Signaling Technology的Cell Fractionation Kit產(chǎn)生了細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜/細(xì)胞器以及細(xì)胞核/細(xì)胞骨架組分，而QIAGEN的Qproteome Cell Compartment Kit分離出細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞核和細(xì)胞骨架組分。

美天旎提供一種不含去污劑的試劑盒，它利用TOM22抗體標(biāo)記的磁珠來(lái)特異分離線粒體。據(jù)該公司的介紹，他們不提供其他亞細(xì)胞組分的產(chǎn)品，但客戶(hù)可以利用自己的抗體來(lái)間接分離其他組分。

同樣地，賽默飛的Cell Surface Protein Isolation Kit標(biāo)記細(xì)胞表面蛋白的外部賴(lài)氨酸，它具有一個(gè)可切割的生物素衍生物，讓此蛋白組分在細(xì)胞裂解后可被捕獲。

其中有什么

在細(xì)胞組分被分離出來(lái)之后，必須驗(yàn)證您的實(shí)驗(yàn)，并確認(rèn)這些組分確實(shí)包含了您要分離的。盡管這些試劑盒通常不包含區(qū)分各種組分的試劑，但許多會(huì)指出不同的看家基因，讓您用來(lái)確保質(zhì)量。Moehlenbrock表示：“在某些情況下，我們會(huì)提供分析的建議。”例如，Sigma-Aldrich Mitochondria Isolation Kit的技術(shù)指南建議檢查細(xì)胞色素c氧化酶活性和檸檬酸合酶活性，以確認(rèn)外膜和內(nèi)膜的完整性。

Cell Signaling Technology也提供Cell Fractionation Antibody Sampler Kit，作為分級(jí)分離試劑盒的伴隨產(chǎn)品。生產(chǎn)科學(xué)家Jim Cormier介紹，當(dāng)您在運(yùn)行Western時(shí)，您會(huì)得到一個(gè)量化值，哪些組分占多少。Sampler Kit包含細(xì)胞質(zhì)MEK1/2、線粒體凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)、組蛋白H3和細(xì)胞骨架波形蛋白的兔單克隆抗體，以及山羊抗兔IgG。

研究人員也可利用試劑盒中的建議，或搜索文獻(xiàn)，組裝自己的Western blot或ELISA試劑盒。不過(guò)Cormier也提醒，并非每個(gè)抗體都有著它應(yīng)有的特異性。

下游的分析

與超速離心相比，基于試劑盒的細(xì)胞分級(jí)分離方法快速又方便，也適合多個(gè)下游應(yīng)用，如EMSA、報(bào)告基因分析、酶活分析和Western blot。

然而，制備過(guò)程中所使用的去污劑和鹽可能阻礙蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用，如質(zhì)譜，“這有時(shí)取決于去污劑的量，去除的容易程度，以及是否用于功能分析，”O’Hara Noonan說(shuō)。“在某些情況下，您可能需要透析或脫鹽。”

同樣地，有時(shí)可能需要額外的步驟，來(lái)增加產(chǎn)物的純度。在讀研究生時(shí)，Moehlenbrock一般使用臺(tái)式離心機(jī)來(lái)制備線粒體。“有時(shí)我會(huì)用11,000 x g來(lái)去除細(xì)胞碎片。之后獲得線粒體提取物，并用蔗糖梯度和超速離心機(jī)來(lái)進(jìn)一步純化。這取決于您想做什么，”他回憶道。

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