溶液配制 

（一）LB培養(yǎng)基 
每1000 mL加分析純NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，用ddH2O配制，再用10 M NaOH調(diào)pH至7.4（100 mL一般加450 µL），高溫高壓蒸汽滅菌15 min冷卻后使用。 
固體培養(yǎng)基加入瓊脂1.5%。 
10 M（或N）NaOH配制方法是稱200 g NaOH加300 mL，攪拌充分溶解后定容至500 mL。 
（二）溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 
溶液Ⅰ：葡萄糖50 mmol/L，EDTA 10 mmol/L，Tris-HCl 25 mmol/L，pH至8.0。可一次配制100 mL，在1.05 kg/cm2高溫高壓蒸汽滅菌15 min，4℃保存。 
溶液Ⅱ：NaOH 0.2 mol/L（從10 N NaOH中現(xiàn)用稀釋），SDS 1%，用現(xiàn)配現(xiàn)用。 
溶液Ⅲ：取5 mol/L乙酸鉀 60 mL，冰乙酸11.5 mL，混合后ddH2O至100 mL。保存于4℃，用時(shí)置于冰浴中。 
1 M Tris-HCl（pH 7.5）配制方法：Tris（MW 12.1）12.1 g 加濃HCl（MW 36.5）72 mL，調(diào)節(jié)pH到7.5并定容到1000 mL。1 M Tris-HCl（pH 8.0）配制方法：12.1 g Tris加800 mL ddH2O，用HCl（~42 mL）調(diào)pH到8.0。等溶液在室溫下冷卻，zui后調(diào)節(jié)pH到8.0并定容到1000 mL。高溫高壓蒸汽滅菌。 
（三）酚-氯仿-異戊醇（25:24:1） 
按25:24:1的比例混勻平衡酚、氯仿、異戊醇，保存于棕色玻璃瓶中，上覆一層Tris-Cl水相，4℃保存?zhèn)溆?。?氯仿-異戊醇混合物在100 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）緩沖液下在不透光的瓶中可保存一個(gè)月之久。 
（四）TE（pH 8.0） 
10 mM Tris-HCl（pH 8.0），1 mM EDTA（pH 8.0），加ddH2O至 1000 mL。高溫高壓蒸汽滅菌?；蛴?00×TE母液稀釋。 
（五）STE 
10 mM Tris-HCl（pH 8.0），0.1 M NaOH，1 mM EDTA（pH 8.0），加ddH2O至1000 mL。高溫高壓蒸汽滅菌。 

小提質(zhì)粒（堿裂解法） 

1、從平板上挑取單菌落或搖甘油菌（5~50 µL），接種于3 mL的LB液體培養(yǎng)基中（加于相應(yīng)的抗生素），37℃振蕩培養(yǎng)至OD600大于2.0，無需過夜。 
通常DH菌株搖 12~16 hr；JM101搖7~8 hr；ER2566搖10~12 hr。 
2、取1.5 mL的菌液于1.5 mL的Eppendorf管（可取未滅菌的新管）中，12000 rpm離心30 sec，棄上清。通常取1.5 mL的菌液再離心一次，棄上清后在紙上扣干。不要忘記將用完的試管及管蓋放入處以備回收處理。 
3、加入100 µL溶液Ⅰ振蕩使菌體沉淀充分懸浮，務(wù)必懸浮充分。 
4、加入200 µL溶液Ⅱ，立即輕輕翻轉(zhuǎn)幾下，使菌體裂解?？捎^察到原渾濁的菌懸浮液變清變粘。 
5、加入150 µL溶液Ⅲ，立即上下顛倒充分混勻7-10次，不宜太劇烈?？捎^察到白色片狀沉淀出現(xiàn)。 
6、置冰浴10 min，也可置于－20℃中5 min。 
7、12000 rpm離心8~10 min。 
8、在離心過程中可取未滅菌的新1.5 mL的Eppendorf管，加入等體積（350~400 µL即可）酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）備用，取滅菌的新1.5 mL的Eppendorf管，加入2倍體積（780 µL體積即可）的無水乙醇于－20℃?zhèn)溆?。加?氯仿-異戊醇時(shí)要小心，應(yīng)吸位于下層的酚相，而不要帶入上層的Tris-Cl保護(hù)液。 
9、離心完將上清迅速倒入已加的酚-氯仿-異戊醇中，充分混勻。小心不要將白色沉淀物倒入酚-氯仿-異戊醇中。
10、12000 rpm離心4~5 min。 
11、吸水相，加入已加好的無水乙醇中，顛倒混勻幾次。小心不要吸入酚相，沒把握時(shí)寧可放棄一些水相。 

15、置于恒溫器上干燥（55℃）至無色透明或無乙醇?xì)馕叮笾烈?~10 min。 
16、加入30~40 µL 1×TE緩沖液溶解沉淀，－20℃儲存?zhèn)溆谩?nbsp;

小量快提質(zhì)粒鑒定 

1、取培養(yǎng)的菌液 1 mL，12000 rpm離心30 sec，收集菌體，在紙上扣干殘留培養(yǎng)液。 
2、用50 µL無菌水充分懸浮菌體。 
3、每管加入50 µL酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）并充分混勻。 
4、12000 rpm離心10 min。 
5、小心吸取50 µL上清電泳（對于插入片4足夠大的重組子，其遷移率應(yīng)低于未插入片段的對照質(zhì)粒）。
大提質(zhì)粒 

1、從－20℃保存的甘油菌吸取50 µL菌液，接種到3~4 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600大于1.6~1.8。 
2、取0.5 mL的菌液于200 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600大于2.0以上。再加入氯霉素至170 µg/mL，37℃振蕩培養(yǎng)搖12~16 hr。 
3、用搖好的菌液4000 rpm離心15 min。 
4、棄上清，敞開管口，倒置，盡量讓上清全部流盡。 
5、用預(yù)冷的40 mL STE充分懸浮菌體沉淀。 
6、4℃，4000 rpm離心15 min。 
7、棄上清，敞開管口，倒置，讓上清全部流盡。 
8、用預(yù)冷的4 mL溶液Ⅰ充分懸浮菌體沉淀。 
9、加入新鮮配制的8 mL溶液Ⅱ，上下顛倒數(shù)次，液體變得澄清，置于4℃10 min。 
10、加入預(yù)冷的溶液Ⅲ 6 mL，上下顛倒充分混勻后，于4℃中放置10 min。 
11、4℃，12000 rpm離心10 min。 
12、收集上清，加等體積的異丙醇，4℃中放置30 min。 
13、4℃，10000 rpm離心10 min。 
14、棄上清，用適量的 70%的乙醇洗沉淀一次，室溫吹干，溶于1 mL 1×TE中。 
15、加50 µL RNase A，37℃作用2 hr。 
16、加入1 mL新配制的13% PEG8000溶液（13% PEG8000，1.6 M NaCl），充分混勻，4℃中放置30 min。 
17、 4℃，12000 rpm離心15 min。 
18、吸去上清，用400 µL 1×TE緩沖液溶解沉淀。 
19、加1/4體積4 M LiCl，室溫下放置5 min，12000 rpm離心5 min。 
20、取上清，用酚、酚-氯仿-異戊醇各抽提一次。 
21、將水相轉(zhuǎn)入一新的Eppendorf管中，加入1/10體積4 M LiCl，2倍體積的無水乙醇，－20℃下放置30 min。 
22、 4℃，12000 rpm離心10 min，棄上清，70%乙醇洗沉淀一次，室溫晾干。 
23、加200 µL 1×TE緩沖液溶解沉淀，測定質(zhì)粒DNA的濃度后于－20℃儲存?zhèn)溆?/p>

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