1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中β 型溶血性鏈球菌（Streptococcus）的檢驗(yàn)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中β 型溶血性鏈球菌的檢驗(yàn)。

2 術(shù)語(yǔ)和定義

2.1 β 型溶血

在菌落周圍形成*透明的溶血環(huán)，紅細(xì)胞*溶解。

2.2 β 型溶血性鏈球菌

能夠產(chǎn)生β 型溶血的化膿（或A 群）鏈球菌（Streptococcus pyogenes）和無(wú)乳（或B 群）鏈球菌

（Streptococcus agalactiae）。

3 設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：

a) 恒溫培養(yǎng)箱： 36 ℃±1 ℃；

b) 冰箱：2 ℃～5 ℃；

c) 厭氧培養(yǎng)裝置；

d) 天平：感量0.1 g；

e) 均質(zhì)器與配套均質(zhì)袋；

f) 顯微鏡：10 倍～100 倍；

g) 無(wú)菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭；

h) 無(wú)菌錐形瓶：容量100 mL、200 mL、2 000 mL；

i) 無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90 mm；

j) pH 計(jì)或pH 比色管或精密pH 試紙；

k) 水浴裝置：36 ℃±1 ℃；

l) 微生物生化鑒定系統(tǒng)。

4 培養(yǎng)基和試劑

4.1 改良胰蛋白胨大豆肉湯（Modified tryptone soybean broth, mTSB）：見(jiàn)附錄A 中A.1。

4.2 哥倫比亞CNA 血瓊脂(Columbia CNA blood agar)：見(jiàn)附錄A 中A.2。

4.3 哥倫比亞血瓊脂(Columbia blood agar)：見(jiàn)附錄A 中A.3。

4.4 革蘭氏染色液：見(jiàn)附錄A 中A.4。

4.5 胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptone soybean broth, TSB）：見(jiàn)附錄A 中A.5。

4.6 草酸鉀血漿：見(jiàn)附錄A 中A.6。

4.7 0.25％氯化鈣(CaCl2)溶液：見(jiàn)附錄A 中A.7。

4.8 3％過(guò)氧化氫(H2O2)溶液：見(jiàn)附錄A 中A.8。

4.9 生化鑒定試劑盒或生化鑒定卡。

5 檢驗(yàn)程序

溶血性鏈球菌檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。

6 操作步驟

6.1 樣品處理及增菌

按無(wú)菌操作稱取檢樣25 g（mL），加入盛有225 mL mTSB 的均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1 min～2 min；或加入盛有225 mL mTSB 的均質(zhì)杯中，以8000 r/min～10000 r/min 均質(zhì)1 min～2 min。若樣品為液態(tài)，振蕩均勻即可。36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h～24 h。

6.2 分離

將增菌液劃線接種于哥倫比亞CNA *，36 ℃±1 ℃厭氧培養(yǎng)18 h～24 h，觀察菌落形態(tài)。

溶血性鏈球菌在哥倫比亞CNA *上的典型菌落形態(tài)為直徑約2 mm～3 mm，灰白色、半透明、光滑、表面突起、圓形、邊緣整齊，并產(chǎn)生β 型溶血。

6.3 鑒定

6.3.1 分純培養(yǎng)

挑取5 個(gè)（如小于5 個(gè)則全選）可疑菌落分別接種哥倫比亞*和TSB 增菌液， 36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h～24 h。

6.3.2 革蘭氏染色鏡檢

挑取可疑菌落染色鏡檢。β 型溶血性鏈球菌為革蘭氏染色陽(yáng)性，球形或卵圓形，常排列成短鏈狀。

6.3.3 觸酶試驗(yàn)

挑取可疑菌落于潔凈的載玻片上，滴加適量3%*，立即產(chǎn)生氣泡者為陽(yáng)性。β 型溶血性鏈球菌觸酶為陰性。

6.3.4 鏈激酶試驗(yàn)（選做項(xiàng)目）

吸取草酸鉀血漿0.2 mL 于0.8 mL 滅菌生理鹽水中混勻，再加入經(jīng)36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18 h～24 h 的可

疑菌的TSB 培養(yǎng)液0.5 mL 及0.25%氯化鈣溶液0.25 mL，振蕩搖勻，置于36 ℃±1 ℃水浴中10 min，血漿混合物自行凝固（凝固程度至試管倒置，內(nèi)容物不流動(dòng)）。繼續(xù)36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24 h，凝固塊重新*

溶解為陽(yáng)性，不溶解為陰性，β 型溶血性鏈球菌為陽(yáng)性。

6.3.5 其他檢驗(yàn)

使用生化鑒定試劑盒或生化鑒定卡對(duì)可疑菌落進(jìn)行鑒定。

7 結(jié)果與報(bào)告

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告每25 g（mL）檢樣中檢出或未檢出溶血性鏈球菌。