219.蘇州華宇凈化工作臺(tái)在一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、的大量肝細(xì)胞培養(yǎng)方法中１材料與方法
１．１ 實(shí)驗(yàn)材料 昆明種封閉群乳小鼠由瀘州醫(yī)學(xué)院 動(dòng)物科提供。ＤＭＥＭ培養(yǎng)基、新生小牛血清均購(gòu)于 Ｈｖｃｌｏｎｅ公司。堿性品紅、偏重亞硫酸鈉、過碘酸（ＡＲ）均為上海試劑廠生產(chǎn)。二氧化碳培養(yǎng)箱（９８００８４４４，Ｕ． Ｓ．Ａ），超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1F．蘇州市華宇凈化設(shè)備有限公司），倒置顯微鏡（ＸＳＴ—Ｄ，重慶光學(xué)儀器廠），超純水儀（Ｍａｘｉｍａ型，英國(guó)）。
１．２ 方法
１．２．１ 肝組織塊的獲得與培養(yǎng)?。薄?ｄ的乳小鼠 ５只，于超凈工作臺(tái)內(nèi)消毒，剖腹，取出肝組織，切割 為約ｌ ｍｍ３的碎塊、ＰＢＳ（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．４）清洗，然后移入玻璃離心管內(nèi)。用眼科剪剪碎至糊狀，加入５ 倍體積的０．１％胰蛋白酶，置３７℃下消化１０ ｍｉｎ，其間 不時(shí)振搖。然后靜置待組織塊沉淀，棄上清液，Ｈａｎｋｓ液洗組織塊２次，以除去血細(xì)胞及其他細(xì)胞；zui后再 用少許１０％小牛血清ＤＭＥＭ培養(yǎng)液洗１次，以充分終 止酶的活性。在消化好的肝組織塊內(nèi)加少許培養(yǎng)液， 混勻后平均轉(zhuǎn)移于５個(gè)培養(yǎng)瓶（５０ｍＬ）內(nèi)，使組織塊 均勻分布，置３７℃、５％ＣＯ：孵箱內(nèi)孵育３ ｈ，組織塊貼 壁后再補(bǔ)加１０％小牛血清培養(yǎng)液４ｍＬ／瓶，繼續(xù)培養(yǎng)， 每?jī)商鞊Q培養(yǎng)液１次，并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
１．２．２肝細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 大約６～７ ｄ肝細(xì)胞長(zhǎng)滿 瓶底，即可傳代。倒去原培養(yǎng)液，加消化液（０．２５％的胰 蛋白酶，Ｏ．０２％的ＥＤＴＡ）覆蓋瓶底，倒置顯微鏡下見細(xì)胞變圓（約３。５ ｍｉｎ），立即倒掉消化液，加１０％小牛 血清培養(yǎng)液洗１次．再加１０％小牛血清培養(yǎng)液４ ｍＬ 輕輕吹打約３ ｍｉｎ后。靜置使組織塊沉淀，轉(zhuǎn)移上層細(xì)胞懸液于另一干凈培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每?jī)商鞊Q培養(yǎng) 液１次。并繼續(xù)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。 原培養(yǎng)瓶去除組織塊后，于倒置顯微鏡下見有散 在細(xì)胞貼附于瓶底．多為梭形、三角形、星形等變形細(xì)胞．采用ＰＡＳ染色法【ｚ】對(duì)原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)殘留細(xì)胞進(jìn)行染 色．大多細(xì)胞胞質(zhì)中未見粉紅色糖原顆粒，核呈空泡 狀。繼續(xù)采用Ｈ．Ｅ復(fù)染胞核，可見空泡狀的核染成紫 藍(lán)色，未見有雙核細(xì)胞（圖ｌａ，本文照片見封三）。
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