如果噬菌體篩選的過程在微孔板中進(jìn)行，靶標(biāo)蛋白固定的基本條件也就建立起來了。通過預(yù)先包被親和素（avidin）或者抗標(biāo)簽的抗體之類的試劑，把靶標(biāo)蛋白間接地固定到包被過的微孔板上，這樣固定方法對于噬菌粒結(jié)合性檢測是有益的。盡管如此，由于噬菌粒結(jié)合性檢測中使用溶液相的靶標(biāo)作為結(jié)合的競爭劑來生成結(jié)合性曲線，所以不應(yīng)該通過使用抗靶標(biāo)的抗體來進(jìn)行固定。下面我們給出一個把靶標(biāo)蛋白直接固定到微孔板上的典型實(shí)驗(yàn)方案。
靶標(biāo)包被的微孔板的準(zhǔn)備
[器材和試劑]
● 9孔板（Nunc Maxisorp）
● 50mmol/L的碳酸鈉緩沖液，pH 9．4
● 醋酸酯平板蓋（Acetateplatesealer；Dynex）
● PBST：含0．05％Tween-20（體積分?jǐn)?shù)）的磷酸鹽緩沖液，pH 7．4
● CBB：酪蛋白封閉緩沖液（Pierce）
● 8通道P200型多通道移液槍
● 自動洗板儀（Skatron或類似產(chǎn)品）
[方法]
1．將溶于碳酸鈉溶液（預(yù)先確定的濃度見實(shí)驗(yàn)方案5．2）的靶標(biāo)蛋白加入96孔板的底部， 每孔100u1。在無靶標(biāo)的對照孔中，只加入lOOul碳酸鈉溶液。
2．微孔板蓋好，小心地將微孔板放入4℃冰箱中，不要擾動包被液，孵育過夜。
3．將微孔板內(nèi)溶液甩出，然后將微孔板倒扣在吸水紙上，吸干殘留液體。
4．在所有孔中馬上加入CBB（不加去垢劑）進(jìn)行封閉，每孔230ul，在室溫下反應(yīng)30 分鐘。
5．在將要使用微孔板時，吸去微孔板內(nèi)溶液，用PBST將微孔板洗滌三次。
在進(jìn)行噬菌體結(jié)合性檢測前，用來包被的靶標(biāo)蛋白的濃度，以及在競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)中加入的噬菌體的濃度，都必須事*行測定。兩個過程zui初都可以利用保存的野生型噬菌體，在一個二維方格（two—dimensional grid）中同時進(jìn)行。
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