自底物噬菌體顯示技術(shù)出現(xiàn)以來，人們對(duì)此技術(shù)進(jìn)行了很多完善和修改，并應(yīng)用于實(shí)際之中。在zui后，我們將對(duì)一些類似的系統(tǒng)進(jìn)行綜述，并描述其在解決一系列科研難題中的工用。
1 底物消減文庫
這是一種改良的底物噬菌體技術(shù)，用于區(qū)別兩種不同蛋白酶的底物特異性。首先的幾輪篩選使用*種蛋白酶篩選底物文庫，將陽性底物分離出來。之后，又用第二個(gè)蛋白酶底物對(duì)此陽性底物進(jìn)行篩選，分離得到非底物序列。結(jié)果，得到的序列能夠被*個(gè)酶水解，但是不能夠被第二個(gè)蛋白酶水解。這種方法被用于區(qū)別纖溶酶原激活物t-PA和u—pA的特異性。盡管兩種蛋白酶都可以切割在P2和P1位點(diǎn)上的同一種GR序列，但是通過這種方法發(fā)現(xiàn)u-PA優(yōu)先切割P3位點(diǎn)的*，而t-PA更偏向于切割體積較大的氨基酸，如*和*。
2 肽段連接酶的底物特異性
多種底物噬菌體展示技術(shù)被用于闡明一個(gè)工程連接酶的底物特異性。一種其活性位點(diǎn)221位*突變成半*、225位*突變成*的枯草桿菌蛋白酶變異體，被發(fā)現(xiàn)可以將脂化的肽段連接到其他肽段或蛋白的N末端。通過將噬菌體展示的hGH前三個(gè)密碼子隨機(jī)化制備底物噬菌體文庫，讓它與枯草桿菌蛋白酶變異體在*連接的肽脂（亞氨基*—KGAAPF-甘油—F—酰氨）存在的情況下一起反應(yīng)，用抗*蛋白的瓊脂糖珠捕獲而分離連接后的底物噬菌體。這樣，文庫中那些含有連接反應(yīng)的良好親核試劑的文庫多肽就被選擇性地富集。以此方法得到的結(jié)果與使用合成底物得到的結(jié)果符合得很好，尤其是在P1，位點(diǎn)上。
3 蛋白激酶的底物特異性
底物噬菌體的概念也被成功地?cái)U(kuò)展到序列特異性的蛋白磷酸化研究之中。在這些研究中，分離步驟依靠的是一個(gè)能夠分離磷酸化底物和非磷酸化底物序列的捕獲試劑。盡管有許多抗磷酸化肽段抗體存在，必須小心地確保捕獲步驟中僅涉及識(shí)別磷酸化的氨基酸，而捕獲集團(tuán)本身不會(huì)對(duì)序列產(chǎn)生任何的偏好。這種底物噬菌體文庫的“捕獲的編輯”使分離磷酸化*和磷酸化*殘基，要比分離更大的磷酸化*更加困難。至少有一篇用噬菌體文庫對(duì)包含磷酸化*和磷酸化*殘基的底物進(jìn)行篩選的報(bào)道[2叼。然而，在這個(gè)例子中，捕獲抗體僅特異性識(shí)別細(xì)胞分裂期（M期）的磷酸化蛋白，因此僅能篩選出同時(shí)帶有此抗體表位的激酶底物。
現(xiàn)在已經(jīng)有部分蛋白*激酶用此方法進(jìn)行研究，包括c-Src、Blk、Lyn、Syk以及Fyn?？梢允褂脙煞N不同的噬菌體展示系統(tǒng)：一種是利用底物文庫與全長的基因Ⅲ融合的單價(jià)展示系統(tǒng)，另一種是將底物文庫與基因Ⅷ融合的多價(jià)展示系統(tǒng)。像在蛋白酶底物展示中一樣，必須進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以優(yōu)化篩選條件，并證實(shí)可以通過此方法特異性地富集陽性底物序列。在肽段磷酸化酶的篩選中，理論上噬菌體的包膜蛋白能夠與底物文庫一樣被激酶修飾，使得特異性篩選更加困難。另外，如果激酶含有磷酸化肽段結(jié)合性區(qū)域（如SH2）能夠與磷酸化的噬菌體肽段相互作用而篩選出非特異性的底物，那么使用多價(jià)展示系統(tǒng)篩選底物可能會(huì)使問題變得更加復(fù)雜[22）。然而，小心地對(duì)待這些問題，底物噬菌體展示技術(shù)可以成功地應(yīng)用于確定密切相關(guān)的兩種蛋白*激酶的不同特異性。
4 用反轉(zhuǎn)錄病毒展示載體（retroviral display vector）進(jìn)行的體內(nèi)篩選
Buchholz等人使用另一種替代方法即利用反轉(zhuǎn)錄病毒載體展示底物文庫，從而使得底物篩選的過程能夠在完整的哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。在這種篩選過程中，表皮生長因子（EGF）與病毒的一個(gè)包膜蛋白融合，因而使得病毒的感染性在富含EGF受體的細(xì)胞中大大降低，而在酶切作用下釋放EGF使得病毒恢復(fù)了感染活性。通過在EGF和包膜蛋白之間插入隨機(jī)的底物序列，測(cè)定切割/感染活性，作者得以證實(shí)那些具有細(xì)胞蛋白酶的弗林蛋白酶/激素原轉(zhuǎn)化酶（furin/prohormoneconvertase）家族共有酶切位點(diǎn)的底物的富集。
自出現(xiàn)開始，底物噬菌體展示技術(shù)就顯示了其在探測(cè)底物活性中強(qiáng)大的作用。許多不同的實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了一系列底物噬菌體展示載體，并用于測(cè)定許多酶（主要為蛋白酶和蛋白激酶）的底物序列。然而其應(yīng)用前景比這些還廣闊得多；很多肽段轉(zhuǎn)錄后的修飾也能應(yīng)用于底物噬菌體展示的方法。zui后，幾個(gè)的應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)的新方法正在開始出現(xiàn)。這其中包括在更廣意義上的探測(cè)酶與底物間相互作用的方法，在這種情況下，酶與底物都被展示于同一個(gè)噬菌體顆粒上。
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