在許多情況下，在大型家養(yǎng)動物中進(jìn)行的基因組修飾，是可取的。在過去，這只能通過冗長而繁瑣的克隆程序才能進(jìn)行。近期，來自軍事醫(yī)學(xué)*放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所、第三軍醫(yī)大學(xué)、南京大學(xué)、國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心和廣州醫(yī)科大學(xué)附屬*醫(yī)院的研究人員，通過使用的基因組編輯工具CRISPR/Cas9，將*cDNA敲入豬Alb基因位點，產(chǎn)生了重組人血清白蛋白（rHSA）。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在zui近的《Scientific Reports》。延伸閱讀：用轉(zhuǎn)基因番茄工業(yè)化生產(chǎn)天然化合物
北京蛋白質(zhì)組研究中心副主任張普民教授和第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部實驗動物學(xué)教研室主任魏泓教授，是本文共同通訊作者。南京大學(xué)模式動物研究中心的黃行許教授也是本文共同作者之一。
人血清白蛋白（HSA）是血漿中含量zui豐富的蛋白質(zhì)，在人體生理學(xué)中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，包括血漿膠體滲透壓的維護(hù)、調(diào)節(jié)體液分布、小分子運(yùn)輸?shù)鹊龋且恍﹪?yán)重疾?。ㄈ绺喂δ芩ソ吆屯鈧孕菘耍┑某Ｒ?guī)處方藥。由于人類血液供應(yīng)不足以及與人類血液相關(guān)的風(fēng)險，科學(xué)家們一直都在尋求人血清蛋白的替代生產(chǎn)。
之前，有科學(xué)家以Albumin-GFP融合的形式進(jìn)行顯性轉(zhuǎn)基因表達(dá)，在豬中生產(chǎn)出了重組HSA。然而，在轉(zhuǎn)基因的方法當(dāng)中，由于存在內(nèi)源性的豬白蛋白，因此，rHSA的分離和純化都是有疑問的。
在這項研究中，研究人員利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因組修飾中的力量，通過將人血清白蛋白cDNA敲入豬的白蛋白基因位點，在豬當(dāng)中生產(chǎn)重組人血清白蛋白。
通過將人ALB cDNA加SV40 polyA信號序列（總長2368bp），注入豬Alb位點下游起始密碼子，研究人員希望人類ALB能在豬內(nèi)源性白蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下表達(dá)，同時阻止豬內(nèi)源性白蛋白的表達(dá)。研究人員設(shè)計了一個sgRNA靶定起始密碼子區(qū)域，并生成一段目標(biāo)片段（同源重組的供體），在兩側(cè)插入1 kb的同源序列。
因為用于供體的5′同源序列達(dá)到了起始密碼子，它包含sgRNA序列，從而可以在同源重組后被sgRNA靶定作為供體或敲入基因。為了防止這種情況發(fā)生，研究人員在起始密碼子之前向sgRNA序列中插入了6 bp（gccacc）。sgRNA是在體外轉(zhuǎn)錄、純化，并連同Cas9 mRNA和包含靶片段的循環(huán)載體，一起注入受精卵。卵母細(xì)胞的來源是巴馬小型豬。在植入發(fā)情期的同步雌性豬之前，注射的胚胎被培養(yǎng)了1到2 小時。約300只胚胎被植入10名雌性豬體內(nèi)，其中5只豬懷孕，并產(chǎn)下了16只活的幼崽。幼崽在標(biāo)準(zhǔn)的照顧下，并沒有出現(xiàn)任何不尋常健康問題的跡象。
經(jīng)過基因型分析，研究人員發(fā)現(xiàn)，16只豬仔攜帶了預(yù)期的敲入基因，這些豬仔血液中存在人血清蛋白。此外，這個敲入的等位基因被成功地傳遞給后代。精密基因組工程的這一成功，有望促進(jìn)科學(xué)家探索豬和其他大型家養(yǎng)動物，用以生產(chǎn)生物醫(yī)學(xué)產(chǎn)品，或選育具有更理想性狀的家畜品種。
