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公司動(dòng)態(tài)

大量制備血清噬菌粒克隆

閱讀：617發(fā)布時(shí)間：2010-7-30

[器材和試劑]
● LB+Amp
● LB+Amp/Glu[LB ，50ug/ml Amp，l％葡萄糖]
● IPTG
● M13K07輔助噬菌體（Stratagene）
● PEG 8000（Sigma）
● NaCl
● TBS
● SW40異質(zhì)同晶聚合物管（Beckman）

[方法]
1．將含有單克隆噬菌粒的菌落接種到10ul LB+Amp/Glu中，37℃過夜培養(yǎng)（在lac啟動(dòng) 子的控制下，葡萄糖能抑制pⅧ基因的表達(dá)）。
2．用500ml LB+Amp稀釋過夜培養(yǎng)液，使之OD600＝0．05；并在37℃下用2L燒瓶劇烈 振蕩培養(yǎng)（至少300r/min），直到OD600＝0．25。
3．37℃極溫和攪動(dòng)孵育15分鐘。加入IPTG（終濃度為0．1mmol/L）誘導(dǎo)源自lac啟動(dòng) ·子的pⅧ表達(dá)，并用輔助噬菌體M13K07（mol＝30）進(jìn)行超感染?；旌喜⒃?7℃下靜置15分鐘感染。37℃劇烈振蕩孵育培養(yǎng)物5小時(shí)。
4．將細(xì)菌/噬菌體上清在4℃5000r/min離心30分鐘，回收上清液。
5．加PEG 8000和NaCl溶液（其終濃度分別為4％和0．5mol/L）沉淀噬菌體顆粒，4℃冰上4小時(shí)。
6．4℃5000r/min離心40分鐘回收噬菌體沉淀，并用1/10原體積的TBS重懸。
7．70℃水浴孵育噬菌體上清30分鐘，使污染的細(xì)菌蛋白變性；再4℃10000r/min離心30分鐘除之。
8．將PEG 8000/NaCl加入所得到的上清，再次沉淀噬茵體，4℃冰上孵育2小時(shí)。
9．4℃10000r/min離心30分鐘， 用10ml PBS重懸噬菌體沉淀。 以8000r/min再次離心15分鐘，以去除不溶物質(zhì)。
10．在LB+Amp平板上滴定噬菌體TU值。

 


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