（一）基本原理
Sano等（1992）利用基因工程的方法表達(dá)了A蛋白與鏈霉親和素的嵌合體分子獲得成功，建立了免疫PCR技術(shù)。這是一種新的抗原檢測(cè)系統(tǒng)，利用細(xì)胞工程和基因工程技術(shù)，巧妙地將抗原抗體反應(yīng)的特異性同PCR的敏感性相結(jié)合，通過(guò)構(gòu)建單克隆抗體與重組核酸的嵌合體分子，使得利用PCR技術(shù)檢測(cè)蛋白成為可能。隨后在免疫PCR的基礎(chǔ)上，建立了在細(xì)胞或組織原位檢測(cè)抗原的原位免疫PCR（in situ immuno-PCR）。
原位免疫PCR是一種檢測(cè)系統(tǒng)，需要一種中介分子同時(shí)具有與DNA和抗體分子特異性結(jié)合的能力，其一端連接DNA，另一端連接抗原—抗體復(fù)合物，形成一個(gè)抗原—抗體—DNA連接物。作為標(biāo)記的DNA分子用PCR擴(kuò)增，檢測(cè)特異的PCR產(chǎn)物，即可間接證明抗原的存在。該技術(shù)與原位PCR不同，就是在PCR與原位雜交之間加了抗體的因素。原位PCR是先對(duì)切片或涂片進(jìn)行PCR，以對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)的DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增，使其拷貝數(shù)大大增加，然后再進(jìn)行原位分子雜交。而該技術(shù)是先用特異性抗體（單抗）與相應(yīng)或目的抗原反應(yīng)。這個(gè)抗體在對(duì)抗原反應(yīng)之前加上了人體不存在的或無(wú)關(guān)的DNA序列。抗體與抗原特異性反應(yīng)后，用PCR擴(kuò)增加在抗體上的DNA序列，然后再用該DNA序列的探針進(jìn)行雜交檢測(cè)，也就是說(shuō)用PCR及雜交的方法來(lái)放大免疫組織化學(xué)的反應(yīng)，檢測(cè)目標(biāo)是蛋白質(zhì)。
（二）操作流程
（1）4um石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。
（2）0．3％H202處理20min；PBS洗3min×3。
（3）抗原修復(fù)，或3mol/L酶消化；PBS洗3rain×3
（4）加入特異性一抗，37℃，1h；PBS洗3min× 3。
（5）加人*化二抗（1：400），37℃，1h；PBS洗3min× 3。
（6）加入鏈霉親和素（1：100），37℃，1h；PBS洗3rain× 3。
（7）加人*化pUCl9 DNA；20ng/片37℃，1h；PBS洗3min× 3。
（8）PBS洗，進(jìn)行原位PCR反應(yīng)（在原位PCR儀上進(jìn)行）。50×反應(yīng)液中含25umol/L引物1ul，2mmol/L dUTPs（1mmol/L dTTP和*—dUTP、20mmol/L dATP和dCTP）各lul，10X緩沖液5ul，Taq酶2U。原位PCR程序?yàn)椋?4℃，40s；55℃，40s；72℃，20s；循環(huán)30次，zui后72℃延伸5min；PBS洗3min×3。
（9）加入鏈霉親和素—HRP（1；200），37℃，30rain；PBS洗3min×3。
（10）DAB+H202顯色。
（11）常規(guī)蘇木精襯染和封片。
（三）應(yīng)注意的問(wèn)題
（1）防止非特異性染色。所用的外源性DNA片段和引物必須和人體內(nèi)基因或被檢靶細(xì)胞中無(wú)互補(bǔ)系列，防止非特異性結(jié)合，出現(xiàn)假陽(yáng)性。
（2）采用尿素或微波抗原修復(fù)方法替代酶消化切片，避免微量殘存蛋白酶對(duì)Taq酶的降解，影響PCR擴(kuò)增的效率，使敏感性下降。
（3）防止脫片，充分洗滌，防止非特異性結(jié)合和擴(kuò)散。
（4）必須設(shè)計(jì)各種陽(yáng)性和陰性對(duì)照。
以上方法主要是增加免疫組化敏感性的方法，當(dāng)然再敏感也應(yīng)保持特異性，不然提高敏感性就毫無(wú)意義，敏感性是在保留特異性的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。
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