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技術(shù)文章

培養(yǎng)細(xì)胞的免疫酶標(biāo)抗體染色法

閱讀：466發(fā)布時(shí)間：2012-2-16

免疫酶組織化學(xué)技術(shù)是以酶作為抗原抗體反應(yīng)的標(biāo)記物，酶催化相應(yīng)的 底物，形成一種不溶性的反應(yīng)產(chǎn)物。光鏡觀察時(shí)，要求形成的終產(chǎn)物為不溶性的有色沉淀， 而電鏡觀察時(shí)，則要求酶反應(yīng)的終產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)處理后，具有較高的電子密度。辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)是目前應(yīng)用zui多的酶標(biāo)記物，具有穩(wěn)定性強(qiáng)和酶反應(yīng)特異性高等優(yōu)點(diǎn)。

1)0．1mol／LPB(pH 7．2)配制的4％多聚甲醛原位固定(4℃)1小時(shí)；
2)2％H2O2／甲醇處理(可省略)，室溫20分鐘，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；
3)PBS漂洗后1％BSA室溫孵育15分鐘；
4)特異性抗體(*抗體)室溫孵育3小時(shí)或4℃孵育過(guò)夜；
5)PBS充分漂洗后，HRP或*標(biāo)記的第二抗體室溫孵育30—60分鐘，如系*標(biāo)記的第二抗體，反應(yīng)后則需進(jìn)一步按ABC試劑盒要求操作；
6)PBS漂洗后，1％戊二醛0．1m01／LPB配制固定30—60分鐘，PBS漂洗；
7)呈色反應(yīng)：0．03％～0．05％DAB 0．0l％H>(L／0．05mol／LTris—HCl(pH 7．6)顯色，適時(shí)終止反應(yīng)，PBS漂洗；
8)1％OsO4后固定30～60分鐘；
9)樣品的脫水、原位包埋、超薄切片制作及電鏡觀察等與常規(guī)電鏡相同。

培養(yǎng)細(xì)胞的免疫酶標(biāo)抗體染色法電鏡圖
顯示胸腺細(xì)胞表面：thy1.2抗原分布(箭頭所示)


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