作為新一代基因組編輯技術先鋒，CRISPR炙手可熱，這種zui初被微生物學家用以了解細菌免疫力的技術方法在過去的5年里，研究人員已經轉而將CRISPR/Cas9發(fā)展為生物學研究的有力工具。近期來自加州大學伯克利分校，霍德華休斯醫(yī)學院等處的研究人員破解了關鍵酶Cas9識別全基因組中靶標的重要機制，這將有助于更有效的完善CRISPR基因編輯技術。
這一研究成果公布在11月12日Science雜志上。
領導這一研究的是加州大學伯克利分校Jennifer Doudna教授，Doudna教授與Emmanuelle Charpentier 2012年在Science雜志上發(fā)表的一項論文中指出，細菌用以對抗病毒的CRISPR-Cas9系統可以作為簡單、靈活的基因組編輯工具，由此她倆獲得了生命科學突破獎（Breakthrough Prize in Life Sciences）。
在研究CRISPR序列過程中，科學家們發(fā)現許多與這些序列功能存在關聯的核酸酶或螺旋酶, 統稱為CRISPR-相關因子(CRISPR-associated, Cas), 這也就是CRISPR-Cas系統的由來。
其中，具有核酸內切酶活性的Cas蛋白是細菌獲得抗性，催化DNA剪切的關鍵所在，但是至今為止我們對于這種酶如何在這么龐大的全基因組中進行搜尋，如何跳過那些“無用"的序列，找到靶標序列的機制知之甚少。
在這篇文章中，研究人員利用時差單分子成像技術（time-lapsed single molecule）追逐了活體小鼠細胞中的Cas-9蛋白，然后用這一數據計算Cas9蛋白保持穩(wěn)定的概率。
Cas9蛋白作用需要crRNA（CRISPR-derived RNA）通過堿基配對與tracrRNA（trans-activating RNA）結合形成雙鏈RNA：tracrRNA/crRNA二元復合體指導其在crRNA引導序列靶定位點剪切雙鏈DNA。Cas9核酸酶有兩個功能結構域：RuvC和HNH。當兩個結構域激活時，HNH核酸酶結構域剪切互補鏈， RuvC結構域剪切非互補鏈，在基因組上產生雙鏈斷裂（DSB）。
在追蹤過程中，研究人員發(fā)現Cas9行動非?？?，在一秒不到的時間里就能鑒別基因序列是不是靶標，而且雖然Cas9能快速分散到整個基因組大部分區(qū)域內，但是在稠密的異染色質DNA中，Cas9速度會降低，這些區(qū)域也就是緊密包裝的染色質區(qū)域，經常出現在細胞核的周圍。不過即使在這里Cas9受到了束縛，但是仍然能結合上去。
這些發(fā)現揭示了Cas9蛋白在基因組中進行搜尋的機制，表明Cas9的快速“跳過"機制是確保CRISPR作用的前提，這一新見解將有助于完善CRISPR基因編輯技術。
同期Nature雜志也發(fā)表了這一研究組的相關成果：Cas9 的HNH核酸酶結構域構象狀態(tài)直接控制了DNA切割活性。
在這篇文章中，研究人員提出了一個模型：Cas9核酸內切酶利用了多個層次的調控來確保切割靶DNA。除了通過PAM結合及在sgRNA–DNA互補基礎上定向解旋DNA識別潛在靶序列，識別靶DNA序列驅動了HNH核酸酶結構域發(fā)生了構象改變。這一結構轉變觸發(fā)了RuvC結構域催化活性，確保了協調切割兩條DNA鏈。部分互補的脫靶DNA序列或許可以穩(wěn)定結合Cas9，但卻無法驅動HNH構象改變，從而避免的切割。
