CRISPR/Cas已成為強有力的基因組編輯技術，并已成功地應用于許多生物，其中包括幾個植物物種。然而，在植物中，基因組編輯試劑載體的傳遞仍然是一個挑戰(zhàn)。zui近，來自清華大學和中科院微生物研究所的研究人員，在Nature子刊《Scientific Reports》發(fā)表的一項研究中，報道了一個基于病毒的引導RNA（gRNA）傳遞系統(tǒng)，用于CRISPR/Cas9介導的植物基因組編輯（VIGE），可以用來地靶定基因組位置，并引發(fā)突變。
本文通訊作者是清華大學生命科學學院的劉玉樂教授。劉玉樂教授1988年畢業(yè)于南開大學，1992年在中科院微生物研究所獲碩士學位，1997年，獲中科院微生物研究所與英國蘇格蘭作物研究所聯(lián)合培養(yǎng)博士，曾在英國蘇格蘭作物研究所、美國德克薩斯大學奧斯丁分校、美國耶魯大學做過訪問學者、博士后和Associate Research Scientist，2007年至今為清華大學教授，“百人計劃"責任教授，博士生導師，國家杰出青年基金獲得者。研究方向為植物免疫的信號傳導與調控、植物病毒病理的分子基礎、植物細胞自噬、植物功能基因組。研究成果多次發(fā)表在Plant Physiology、PLoS Pathogens、Plant Cell、Molecular Plant、New Phytologist、Journal of Biological Chemistry、Developmental Cell等學術期刊。
基因組修飾是植物遺傳學研究的核心和關鍵步驟，這可以通過隨機和靶向（位點特異性）誘變完成。雖然目前有很多生成隨機基因突變的工具，如通過誘變劑的化學誘變、通過快中子輻照的物理誘變、γ射線或X射線，以及在植物中通過轉座子或T-DNA的生物誘變，但是，我們很難將所需的突變與隨機突變區(qū)分開來。為了克服這種局限性，科學家們開發(fā)出三種方法，包括鋅指核酸酶（ZFN）、TAL效應器核酸酶（TALENs）和CRISPR/Cas編輯系統(tǒng)，通過在多種生物（包括植物）中誘導特定位置的DNA雙鏈斷裂，完成位點特異性誘變，這會刺激細胞的DNA修復機制，包括容易出錯的非同源和末端連接（NHEJ）。
CRISPR/Cas DNA編輯系統(tǒng)，是開發(fā)的一種用于基因組工程的新方法。它基于細菌對抗入侵DNA病毒和/或質粒的II型CRISPR/Cas（CRISPR相關）免疫系統(tǒng)。II型CRISPR/Cas系統(tǒng)利用整合到CRISPR位點的外源DNA片段，隨后通過轉錄加工成CRISPR RNAs（crRNAs）。反過來，crRNAs退火以反式激活crRNAs（tracrRNA）和并產生向導RNA（gRNA），指導序列特異性切割并通過Cas蛋白沉默外來入侵的DNA。在zui近開發(fā)的CRISPR/Cas DNA編輯系統(tǒng)中，gRNA可以指導核酸內切酶Cas9靶來誘導特異位點的精密切割。CRISPR/Cas系統(tǒng)可在哺乳動物細胞和整個生物體中實現(xiàn)基因敲除，如酵母、斑馬魚和線蟲。后來，這種方法被迅速用于植物，在植物學研究中，它通過瞬態(tài)實驗和轉基因植物繼續(xù)表現(xiàn)出其適用性。延伸閱讀：中國農科院用CRISPR實現(xiàn)大豆基因組編輯。
CRISPR/Cas比ZFNs和TALENs更有利，因為它只需要一個單一的Cas9核酸酶，可以通過設計gRNA而編程，以指導靶特異性切割，但它不需要精心設計以及耗時的單個DNA結合蛋白裝配。有研究證明，CRISPR/Cas系統(tǒng)在植物中能夠通過瞬態(tài)實驗或轉基因植物實現(xiàn)的基因編輯。在大多數(shù)情況下，Cas9與gRNAs是通過農桿菌介導的T-DNA轉化或物理手段傳遞到植物細胞的，如PEG介導的原生質體轉化或愈傷組織的基因槍轉化。
雙生病毒DNA復制可以提高基因打靶頻率。zui近，據報道，煙草花葉病毒（TRV）——一種在細胞質中復制的RNA病毒，可以將gRNAs傳遞到轉基因的Cas9表達煙草中，以實現(xiàn)系統(tǒng)的基因組編輯，甚至可以在兩個后代植株中被檢測到。然而，在植物中還沒有基于DNA病毒的基因組編輯傳遞系統(tǒng)。
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白菜卷葉病毒（CaLCuV）是雙生病毒家族中的菜豆金黃花葉病毒屬，在細胞核中復制。它通過兩個獨立的基因組編碼七種蛋白。目前，科學家已將CaLCuV開發(fā)為一種病毒誘導的基因沉默（VIGS）和miRNA表達載體。CaLCuV可感染十字花科和茄科中的許多宿主，延伸了其在植物生物技術中的應用。
病毒誘導的基因沉默（VIGS）被廣泛應用于植物基因功能研究。然而，VIGS只能下調基因表達，在不同發(fā)育階段其有效性有所差異。為了克服這些局限性，在這項研究中，研究人員利用一種DNA病毒，在植物中進行系統(tǒng)的基因敲除。病毒介導的基因敲除將沒有這些局限性。
他們報道稱，CaLCuV——一種雙生病毒，能夠在植物中傳遞gRNA和誘導系統(tǒng)性的基因突變。研究人員使用修改的CaLCuV載體完成了植物基因組編輯（VIGE），在表達Cas9的穩(wěn)定轉基因植物中表達gRNAs。
DNA測序在未接種葉子中證實了內源基因NbPDS3和NbIspH的VIGE，因為CaLCuV可以系統(tǒng)地感染植物。此外，在新發(fā)育的葉片中，NbPDS3和NbIspH的VIGE，可引起光漂白表型。這些結果表明，雙生病毒為基礎的VIGE，可能是植物基因組編輯的一個強大工具。
