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WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果“膜上一片空白”怎么回事?

2019-4-2  閱讀(24329)

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    勁馬專注科研試劑盒的研發(fā)及銷(xiāo)售多年,涉及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域,滿足您實(shí)驗(yàn)所需,以實(shí)現(xiàn)與客戶的雙贏,完善的庫(kù)存及供應(yīng)體系以及穩(wěn)定的專業(yè)技術(shù),保證產(chǎn)品均能現(xiàn)貨供應(yīng)。期待您前來(lái)咨詢選購(gòu)。今天小編給大家?guī)?lái)的是:WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果“膜上一片空白”,什么原因?qū)е碌哪??一起?lái)看看吧!

    一、膠和膜放反了:如果在轉(zhuǎn)印的過(guò)程中,膠和膜的位置顛倒了,那么蛋白就從膠上轉(zhuǎn)移到緩沖液中,而不會(huì)到達(dá)膜上。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)印,凝膠應(yīng)靠近三明治的負(fù)極,而膜對(duì)應(yīng)正極。

    二、轉(zhuǎn)膜效率低:轉(zhuǎn)膜效率受多種因素影響,包括蛋白的大小、凝膠中丙烯酰胺的百分比、電場(chǎng)強(qiáng)度、轉(zhuǎn)印時(shí)間和緩沖液的PH值。一般來(lái)說(shuō),蛋白越大,轉(zhuǎn)移的越慢。轉(zhuǎn)移大蛋白的方法是用高的電場(chǎng)強(qiáng)度。而小蛋白長(zhǎng)時(shí)間處于高電場(chǎng)強(qiáng)度下可能會(huì)傳出轉(zhuǎn)印膜。避免這個(gè)問(wèn)題的方法是用0.2μm孔徑的PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)印。如果蛋白的等電點(diǎn)接近緩沖液的pH值,那么這個(gè)蛋白攜帶的電荷很少,在電場(chǎng)中頁(yè)幾乎不移動(dòng)。如果你的目的蛋白是強(qiáng)堿性的,那么你可以用碳酸鹽(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性緩沖液。

    三、試劑放置太久或存放條件不正確:抗體會(huì)慢慢降解,如果反復(fù)凍融的話,它會(huì)快速降解。底物應(yīng)儲(chǔ)存在-20℃。

    四、抗體不純或滴度太低:一抗的濃度差異很大,應(yīng)該根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)決定一抗的稀釋度。一般的原則是以1:100-1:1000來(lái)稀釋血清或組織培養(yǎng)上清,以1:1000-1:10000來(lái)稀釋腹水或超免疫動(dòng)物的血清。Bio-Rad的印跡級(jí)別的二抗稀釋度是1:3000。

    五、酶失活了:疊氮鈉是辣根過(guò)氧化物酶的抑制劑。不要再HRP顯色的western blot中使用任何含疊氮鈉的試劑。疊氮鈉可以用于堿性磷酸酶結(jié)合的抗體中,而*。另外,只能使用蒸餾的去離子水。

    六、使用Tween-20洗滌:Tween-20(吐溫-20)可能會(huì)干擾某些抗體-抗體相互作用,或洗去PVDF膜上的目的蛋白。因此除了封閉之后的次洗滌,其他洗滌過(guò)程中都不使用Tween-20。

    七、檢測(cè)系統(tǒng)缺乏足夠的靈敏度:確保蛋白的上樣量在檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度范圍內(nèi)。

    勁馬成為國(guó)內(nèi)生命科學(xué)領(lǐng)域ELISA試劑盒的主要供應(yīng)商之一,代理許多先進(jìn)水平的試劑盒,包括分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等多個(gè)研究及應(yīng)用領(lǐng)域,期待能與更多科研單位深入合作,共同打造生物行業(yè)一片藍(lán)天。

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