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底物化學(xué)發(fā)光ECL是Western blotzui常用的顯色方法之一，其原理是辣根過(guò)氧化物酶在H2O2的作用下，氧化化學(xué)發(fā)光物魯米諾（Lumino）并發(fā)光，在化學(xué)增強(qiáng)劑存在下光強(qiáng)度可以增大1000倍，通過(guò)在照相底片上感光就可以檢測(cè)辣根過(guò)氧化物酶的存在。
Fig：ECL發(fā)光檢測(cè)原理示意圖
ECL法具有操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，線性范圍廣等特點(diǎn)，現(xiàn)將該方法使用中zui常出現(xiàn)的問(wèn)題以及解決方法匯總?cè)缦拢?/p>
| 現(xiàn)象 | 原因 | 解決辦法 |
| 信號(hào)弱或無(wú) | HRP過(guò)高引起底物迅速耗竭 | 稀釋一抗/二抗 |
| 抗體-抗原系統(tǒng)敏感性過(guò)低 | 提高抗體濃度/蛋白上樣量 | |
| 轉(zhuǎn)膜不充分/過(guò)轉(zhuǎn) | 優(yōu)化轉(zhuǎn)膜條件 | |
| HRP或底物活性降低 | 測(cè)試活性或選用敏感底物 | |
| 高背景 | HRP過(guò)高(背景較高) | 稀釋一抗/二抗 |
| 封閉時(shí)間不足 | 延長(zhǎng)封閉時(shí)間4度過(guò)夜 | |
| 抗體與封閉液有交叉 | 更換封閉液(如3% BSA的TBST) | |
| TBST洗脫不足 | 增加洗脫時(shí)間、次數(shù)、用量 | |
| 曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng) | 降低曝光時(shí)間 | |
| 抗原-抗體濃度過(guò)高 | 降低抗體濃度或蛋白上樣量 | |
| 條帶內(nèi)無(wú)顯影的白點(diǎn) | 轉(zhuǎn)膜不良（如有氣泡在膠-膜之間) | 精細(xì)操作 |
| 膜平衡不均/油脂污染 | 按說(shuō)明書(shū)平衡膜/戴手套用平頭鑷子持膜 | |
| 膜與X光片間有氣泡 | 顯影前去除氣泡 | |
| 非特異性條帶 | 抗體交叉反應(yīng) | 稀釋一抗/二抗 |
| 散在小圓斑 | 封閉液有雜質(zhì)顆粒 | 靜置牛奶使大顆粒沉淀，僅用上層 |
| 反影(白色條帶,黑色背景) | HRP過(guò)高(背景較高) | 稀釋一抗/二抗 |
| 顯影后膜上條帶處變?yōu)辄S色 | HRP過(guò)高(敏感性太高) | 稀釋一抗/二抗 |
上海勁馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司試劑盒產(chǎn)品特點(diǎn)：
⇒ 高靈敏度的非放射性檢測(cè)系統(tǒng)：可檢測(cè)低至100fg～1pg的抗原，適用于痕量抗原的檢測(cè)。
⇒ 高分辨率：本底極低，即使長(zhǎng)時(shí)間曝光，背景仍然極低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口同類產(chǎn)品。
⇒ 半衰期長(zhǎng)：信號(hào)衰減慢，12個(gè)小時(shí)以上仍可感光X光膠片。
