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2015藥典修訂版：大腸桿菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測(cè)定法
上海勁馬生物可以利用酶聯(lián)免疫法測(cè)定大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的重組制品中菌體蛋白質(zhì)殘留量，具體如下：將兔抗大腸桿菌菌體蛋白抗體包被，結(jié)合菌體蛋白，再和有辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的兔抗大腸桿菌菌體蛋白抗體結(jié)合，加入底物，產(chǎn)生的物質(zhì)在492nm處測(cè)吸光度，與參考品的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，即可得原液中菌體蛋白的含量。
而本法系采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的重組制品中菌體蛋白質(zhì)殘留量。歡迎大家參考學(xué)習(xí)，感謝您對(duì)上海勁馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司的大力支持。
試劑（1)包被液（P H9.6碳酸鹽緩沖液） 稱(chēng)取碳酸鈉0.32g、碳酸氫鈉0 .5 8 6 g ,置200ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。
(2 )磷酸鹽緩沖液（p H 7 . 4 )稱(chēng)取氯化鈉8g、氯化鉀0.2g、磷酸氫二鈉1.44g、磷酸二氫鉀0.24g，加水溶解并稀釋至500ml, 121°C滅菌15分鐘。
(3 )洗滌液（pH7.4) 量取聚山梨酯20 0.5ml，加磷酸鹽緩沖液至500ml。
(4 )稀釋液（p H 7 . 4 )稱(chēng)取牛血清白蛋白0.5g，加洗滌液溶解并稀釋至100ml。
(5 )濃稀釋液稱(chēng)取牛血清白蛋白l.O g , 加洗滌液溶解并稀釋至100ml。
(6 )底物緩沖液（pH 5 .0枸櫞酸-磷酸鹽緩沖液） 稱(chēng)取磷酸氫二鈉（Na2HP04 . 12H20 )1 . 84g、枸櫞酸 0. 51g，加水溶解并稀釋至100ml。
(7 )底物液取鄰苯二胺8mg、30%過(guò)氧化氫30^1，溶于底物緩沖液20ml中。臨用時(shí)現(xiàn)配。
(8 )終止液lm o l/L硫酸溶液。標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備按菌體蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品說(shuō)明書(shū)加水復(fù)溶，精密量取適量，用稀釋液稀釋成每lm l中含菌體蛋白質(zhì)500ng、250ng、125ng、62. 5ng、31. 25ng、15. 625ng, 7. 8125ng的溶液。
供試品溶液的制備 取供試品適量，用稀釋液稀釋成每lml中約含250μg的溶液。如供試品每lml中含量小于500μg時(shí)，用濃稀釋液稀釋1倍。
測(cè)定法 取兔抗大腸桿菌菌體蛋白質(zhì)抗體適量，用包被液溶解并稀釋成每lml中含10μg的溶液，以100μl/孔加至9 6孔酶標(biāo)板內(nèi)，4℃放置過(guò)夜（16?18小時(shí)）。用洗滌液洗板3次；用洗滌液制備1%牛血清白蛋白溶液，以200μl/孔加至酶標(biāo)板內(nèi)，37℃放置2 小時(shí)；將封閉好的酶標(biāo)板用洗滌液洗板3 次；以100μl/孔加人標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，每個(gè)稀釋度做雙孔，同時(shí)加入2 孔空白對(duì)照（稀釋液），37°C放置2 小時(shí)；用稀釋液稀釋辣根過(guò)氧化物酶（HRP)標(biāo)記的兔抗大腸桿菌菌體蛋白質(zhì)抗體1000倍，以100μl/ 孔加至酶標(biāo)板內(nèi)，37°C放置1 小時(shí)，用洗滌液洗板1 0次，以lOOμl/
孔加人底物液，3 7 ℃避光放置4 0 分鐘，以5 0 μl/孔加入終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)4 9 2 n m 處測(cè)定吸光度，應(yīng)用計(jì)算機(jī)分析軟件進(jìn)行讀數(shù)和數(shù)據(jù)分析，也可使用手工作圖法計(jì)算。
以標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度對(duì)其相應(yīng)的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以供試品溶液吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到相應(yīng)菌體蛋白質(zhì)含量，
按以下公式計(jì)算：
供試品菌體蛋白質(zhì)殘留量（％) = （c×n）/（T×106）×100
式中 c為供試品溶液中菌體蛋白質(zhì)含量，ng/ml;
n為供試品稀釋倍數(shù)；
T為供試品蛋白質(zhì)含量，mg/ml。
注：也可采用經(jīng)驗(yàn)證的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測(cè)定。
