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Caspase活性測(cè)試是如何使用的？這個(gè)問題困擾了很多老師。根據(jù)我司歐陽(yáng)技術(shù)的細(xì)心探討，終于得出結(jié)論。活性測(cè)試該如何使用呢？
Caspase活性測(cè)試為在細(xì)胞裂解液中檢測(cè)蛋白酶活性提供了簡(jiǎn)捷方便的手段。當(dāng)對(duì)專一Caspase的多肽底物被裂解時(shí)，釋放出的指示分子可用普通讀光儀或熒光讀板儀來做定量測(cè)定。將從細(xì)胞凋亡樣本得到的信號(hào)同未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照樣本進(jìn)行比較，可以確定Caspase活性增加的倍數(shù)，而Caspase酶活性是同檢測(cè)到的信號(hào)直接成正比。
Caspase是參與細(xì)胞凋亡過程的蛋白酶家族，包含10多個(gè)成員。其中Caspase-1是*可剪切IL-1?和IL-18前體產(chǎn)生活性細(xì)胞因子的caspase。Caspase-11剪切45kD的caspase-1前體蛋白產(chǎn)生20kD和10kD片斷，這兩個(gè)片斷可以形成異源二聚體，并進(jìn)一步形成四聚體。此四聚體具有蛋白酶活性。Caspase-1通過剪切Bcl-XL調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，并通過對(duì)細(xì)胞因子前體的剪切來調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫炎性反應(yīng)。
測(cè)定原理基于Caspase-1特異水解多肽底物Tyr-Val-Ala-Asp-p-nitroanilide (YVAD-pNA)，釋放的游離硝基苯胺pNA在405 nm有zui大吸光度。采用可見光光度比色法測(cè)定pNA而得到Caspase活性。適用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物組織、細(xì)胞Caspase-1活性。
上海勁馬生物根據(jù)樣品測(cè)定操作：
1. 按下表設(shè)置96孔板反應(yīng)體系。底物zui后加入以使各管反應(yīng)起始時(shí)間相同。設(shè)置不加樣品的空白對(duì)照管。酶活力不足或過高，可增加或減少樣品。
2. 蓋緊96孔板蓋子并用封口膜密封。37 ºC反應(yīng)2小時(shí)，肉眼可見顏色變黃時(shí)的OD405值約為0.2，此時(shí)即可測(cè)定。顏色變化不明顯可延長(zhǎng)反應(yīng)或過夜，但酶活性較強(qiáng)時(shí)，孵育時(shí)間過長(zhǎng)將導(dǎo)致反應(yīng)失去線性關(guān)系。
3. 樣品管OD405減去空白對(duì)照OD405，為樣品Caspase水解底物產(chǎn)生的pNA吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量，并以蛋白濃度校正之。
4. 測(cè)得的Caspase酶活性表示方法有兩種。(1) Caspase活性增加的百分比：100% × 實(shí)驗(yàn)處理組OD / 實(shí)驗(yàn)對(duì)照組OD，簡(jiǎn)單而可靠。(2)樣品Caspase酶活力單位/mg protein，但計(jì)算較復(fù)雜，參見說明。
反應(yīng)體系參考表 (允許適當(dāng)調(diào)整樣品加樣量) 無樣品 空白對(duì)照 高酶活性 樣品 低酶活性 樣品 反應(yīng)緩沖液μl 95 85 60 待測(cè)樣品μl － 10 35 底物 μl 5 5 5 總體積μl 100 100 100
