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據(jù)上海勁馬生物技術(shù)部詳解，關(guān)于IHC實驗中包含陽性及陰性對照的具體參數(shù)展示。適當(dāng)?shù)膶φ諏τ贗HC/ICC結(jié)果的準(zhǔn)確闡釋至關(guān)重要。令人滿意的IHC/ICC實驗設(shè)計可產(chǎn)生結(jié)果，說明抗原位于正確的組織、細(xì)胞類型或亞細(xì)胞定位。固定、封閉、抗體孵育和抗原修復(fù)步驟的優(yōu)化將產(chǎn)生強(qiáng)烈而特異的信號。然而，有時實驗也會出現(xiàn)假象哦，蒙蔽了你的雙眼。因此，IHC/ICC實驗必須包含陽性和陰性對照。
此外，抗體特異性、實驗條件、組織類型之間生物學(xué)條件、甚至研究人員的差異都可能產(chǎn)生不一致的染色，導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)論。為了實現(xiàn)性能一致，詳細(xì)記錄是IHC/ICC研究的一個重要因素。在此，我們介紹了一些*的對照，可支持您IHC/ICC結(jié)果的特異性。
內(nèi)源組織背景對照
某些細(xì)胞和組織可能有著固有的生物學(xué)性質(zhì)，產(chǎn)生背景染色，從而導(dǎo)致結(jié)果的誤讀。在一抗上樣之前，應(yīng)利用熒光（適用于熒光標(biāo)記）或明視場（適用于顯色標(biāo)記）照明在顯微鏡下檢查細(xì)胞和組織，以確保組織本身沒有信號。例如，脂褐質(zhì)是一種內(nèi)源的自發(fā)熒光色素，可與陽性染色混淆。
無一抗對照
將組織與抗體稀釋液孵育，其中不包含一抗的對照通常也是必需的。之后與二抗和檢測試劑孵育。只用檢測試劑染色應(yīng)該是可以忽略的，它不會掩蓋特異染色，也不會類似于特異染色的模式。
同型對照
在使用單克隆一抗時，可利用此對照。將樣品與抗體稀釋液孵育，并添加與一抗相同亞型（如IgG1、IgG2A、IgG2B、IgM）和濃度的非免疫球蛋白。之后將樣品與二抗和檢測試劑孵育。這些步驟將確保特異染色所出現(xiàn)的不是由免疫球蛋白分子與樣品的非特異相互作用引起的。背景染色應(yīng)該是可以忽略的，與特異染色不同。
吸附對照
為了證明抗體是與目的抗原特異結(jié)合，首先要將抗體與免疫原預(yù)孵育。這會使抗體失活，組織應(yīng)該無染色或很少染色。抗原與抗體的混合物應(yīng)以10:1（摩爾比）配制，并在4 °C預(yù)孵育過夜。隨后將預(yù)吸附的抗體與組織共同孵育，以取代一抗。將一抗產(chǎn)生的染色模式與預(yù)吸附抗體產(chǎn)生的相比較。
如果免疫原是肽段，那么吸附對照效果更好。不過，如果抗體是由整個蛋白產(chǎn)生的，則抗體與蛋白混合物的添加可能導(dǎo)致更高的非特異染色。盡管機(jī)理還不清楚，但有可能是預(yù)吸附所用的抗原本身與組織結(jié)合，產(chǎn)生非特異染色。因此，必須注意，使用整個蛋白的吸附對照不一定能驗證抗體與組織中蛋白結(jié)合的特異性。組織類型對照
IHC/ICC實驗的其他對照包括使用已知表達(dá)（或不表達(dá)）目的表位的組織樣品。這種策略可提供有用的參考，也可使用在初步優(yōu)化研究中。來自轉(zhuǎn)基因動物的組織特別有用，它們表達(dá)或不表達(dá)抗原。此外，不同物種的組織樣品也可包含在內(nèi)，以支持抗體的物種特異性。
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