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上海“勁馬”蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定
一、實驗原理
蛋白質(zhì)在十二烷基硫酸鈉（SDS）和巰基乙醇的作用下，分子中的二硫鍵還原，氫鍵等打開，形成按1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)比例的SDS-蛋白質(zhì)多肽復(fù)合物，該復(fù)合物帶負(fù)電，故可在聚丙烯酰胺凝膠電泳中向正極遷移，且主要由于凝膠的分子篩作用，遷移速率與蛋白質(zhì)的分子量大小有關(guān)，因此可以濃縮和分離蛋白質(zhì)多肽。
聚丙烯酰凝膠電泳分離蛋白質(zhì)多數(shù)采用一種不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)，主要分為較低濃度的成層膠和較高濃度的分離膠，配制凝膠的緩沖液，其pH值和離子強(qiáng)度也相應(yīng)不同，故電泳時，樣品中的SDS-多肽復(fù)合物沿移動的界面移動，在分離膠表面形成了一個極薄的層面，大大濃縮了樣品的體積，即SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮效應(yīng)。
二、儀器及器材
垂直電泳槽及附件、直流穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、移液器等。
上海勁馬實驗設(shè)備有限公司代理的產(chǎn)品以優(yōu)異的質(zhì)量，熱情的服務(wù)，贏得廣大新老顧客的信任。
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三、試劑
1、凝膠貯備液：稱取30g 丙烯酰胺（Acr）和0.8g 甲叉-雙丙烯酰胺（Bis），蒸餾水溶解后定容至100mL，濾紙過濾貯存。
2、10% SDS：稱取SDS 10g 加蒸餾水至100ml。
3、10%過硫酸胺（AP），用時現(xiàn)配。
4、N，N，N’，N’四甲基乙二胺（TEMED）。
5、電極緩沖液：3.03g Tris、14.14g甘氨酸、1.0g SDS溶于水，混勻后用HCL調(diào)節(jié)pH至8.3，加蒸餾水至1 000ml。
6、樣品溶解（緩沖）液：0.6gTris、5mL甘油（丙三醇）1.0g SDS溶于水，混勻后用HCL調(diào)節(jié)pH至8.0，再加0.1g溴酚藍(lán)、2.5mL巰基乙醇，定容至100mL。
7、下層膠（分離膠）緩沖液：18.17g Tris、0.4gSDS溶于水，混勻后用1mol/L HCL調(diào)節(jié)pH至8.8，加蒸餾水至100ml。
8、上層膠（濃縮膠）緩沖液：6.06g Tris、0.4gSDS溶于水，混勻后用1mol/L HCL調(diào)節(jié)pH至6.8，加蒸餾水至100ml。
9、固定液：25%異丙醇，10%乙酸。
10、染色液：0.125g考馬斯亮藍(lán)R-250加固定液250ml。
11、脫色液：冰乙酸75ml、甲醇50ml，加水定容至1000ml。
12、1.5%瓊脂：1.5g瓊脂溶于100mL電極緩沖液中，加熱溶解。
13、標(biāo)準(zhǔn)相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)。
四、操作步驟
1、電泳槽的安裝
干燥的兩塊玻璃板裝入配套塑料夾套內(nèi)，垂直固定在電泳槽上，周邊用1.5%的瓊脂密封。
2、樣品的制備
稱取1g待測植物鮮樣置于冰浴上的研缽內(nèi)，加入1mL去離子水研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中，再加入2mL去離子水沖洗研缽，3500r/min離心20min，上清液備用。
將標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和待測樣品分別溶于樣品溶解液，在沸水中加熱3-4min，待冷卻后作點樣用。
3、制膠
選擇合適的膠濃度（表1），配制分離膠，混合后將其沿長玻璃板加入兩塊玻璃板之間（小心不要產(chǎn)生氣泡），加到距短玻璃板上邊緣3cm處，立即覆蓋2-3mm水層，靜止聚合約40min左右。膠聚合好的標(biāo)志是膠與水之間形成清晰的界面。
吸取分離膠的水分，將配好的濃縮膠（表1）注入分離膠之上，立即插上有機(jī)玻璃的點樣槽模板，待濃縮膠聚合好備用。
表1 不同濃度凝膠體系
| 凝膠組分（mL） | 分離膠濃度 | 濃縮膠 | ||||
| 7.5% | 10% | 12.5% | 15% | 30% | ||
| 下層膠緩沖液 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | -- |
| 上層膠緩沖液 | -- | -- | -- | -- | -- | 1.25 |
| 貯備液 | 4 | 5.3 | 6.7 | 8 | 10.7 | 0.75 |
| H2O | 8 | 6.7 | 5.3 | 4 | 1.3 | 3 |
| 10%過硫酸銨 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.8 | 0.015 |
| TEMED | 0.008 | 0.008 | 0.008 | 0.008 | 0.008 | 0.005 |
4、點樣
用移液器分別吸取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)5μL和樣品液20μL，注入樣品槽內(nèi)的濃縮膠上面，同時在樣品上小心地注入電極緩沖液。
5、電泳
加樣完畢，電泳槽內(nèi)注入適量電極緩沖液，接通電源（上負(fù)下正），調(diào)節(jié)電流為15mA，當(dāng)指示劑進(jìn)入分離膠后，電流需加大到30mA，電壓恒定在80-100V，約3-4h后，指示劑達(dá)到距離前沿1-2cm時，可終止電泳。
6、固定
膠取出后，在水中浸泡10min，浸出部分SDS，然后將膠浸泡在25%異丙醇和10%乙酸的混合液中1h，蛋白質(zhì)就會到固定。
7、染色
取出凝膠板，加入染色液染色2h。
8、脫色
將膠放在脫色液中脫色0.5h，每隔0.5h換一次脫色液，至少換3次，待藍(lán)色基本脫掉，再放在脫色液里浸泡至蛋白質(zhì)譜帶清晰為止。
9、照相。
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