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凝膠電泳操作注意事項(xiàng)
1.緩沖系統(tǒng)：在沒有離子存在時(shí),電導(dǎo)率zui小,DNA不遷移,或遷移極慢,在高離子強(qiáng)度的緩沖液中,電導(dǎo)很高并產(chǎn)熱,可能導(dǎo)致DNA變性,因此應(yīng)注意緩沖液的使用是否正確.長時(shí)間高壓電泳時(shí),常更新緩沖液或在兩槽間進(jìn)行緩沖液的循環(huán)是可取的.
2.瓊脂糖：不同廠家、不同批號(hào)的瓊脂糖,其雜質(zhì)含量不同,影響DNA的遷移及熒光背景的強(qiáng)度,應(yīng)有選擇地使用.
3.凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致,溶解的凝膠應(yīng)及時(shí)倒入板中,避免倒入前凝固結(jié)塊.倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡,影響電泳結(jié)果.
4.樣品加入量：一般情況下,0.5cm寬的梳子可加0.5μg的DNA量,加樣量的多少依據(jù)加樣孔的大小及DNA中片段的數(shù)量和大小而定,過多的量會(huì)造成加樣孔超載,從而導(dǎo)致拖尾和彌散,對(duì)于較大的DNA此現(xiàn)象更明顯.
5.電泳系統(tǒng)的變化會(huì)影響DNA的遷移,加入DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物進(jìn)行判定是必要的.
6.DNA樣品中鹽濃度會(huì)影響DNA的遷移率,平行對(duì)照樣品應(yīng)使用同樣的緩沖條件以消除這種影響.
7.DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度,遷移分子的形狀及大小.采用不同濃度的凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子,制備瓊脂糖凝膠可根據(jù)DNA分子的范圍來決定凝膠的濃度.小片段的DNA電泳應(yīng)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳以提高分辨率.
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