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大鼠雌二醇 ELISA試劑盒說明書

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                Rat Estradiol ELISA Kit

                             Catalog No. CSB-E05110r

                                           （96T）

     This   immunoassay   kit   allows   for   the   in   vitro   quantitative   determination   of  rat   Estradiol

     concentrations in serum, plasma and other biological fluids.

     Expiration date    six months from the date of manufacture

     FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.

                               CUSABIO BIOTECH CO., LTD.

                      /   /

                     : cusabio@    cusabio@

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INTRODUCTION

Estradiol （E2 or 17β-estradiol） （also oestradiol） is a sex hormone. During

the    reproductive     years,   most    estradiol    in  women      is produced      by   the

granulosa   cells   of   the   ovaries   by   the   aromatization   of   androstenedione

（produced in the theca folliculi cells） to estrone, followed by conversion

of estrone to estradiol by 17β-hydroxysteroid reductase. Smaller amounts

of estradiol are also produced by the adrenal cortex, and （in men）, by the

testes.    Estradiol    is  not  only    produced     in  the   gonads:     in  both   sexes,

precursor       hormones,       specifically      testosterone,      are   converted        by

aromatization   to   estradiol.   In   particular,   fat   cells   are   active   to   convert

precursors to estradiol, and will continue to do so even after menopause.

Estradiol   is   also   produced   in   the   brain   and   in   arterial   walls.   Estradiol

enters   cells   freely   and   interacts   with   a   cytoplasmic   target   cell   receptor.

When the estrogen receptor has bound its ligand it can enter the nucleus

of    the   target   cell,   and   regulate     gene    transcription     which     leads   to

formation   of   messenger   RNA.   The   mRNA  interacts   with   ribosomes   to

produce   specific   proteins   that   express   the   effect   of   estradiol   upon   the

target cell. Estradiol binds well to both estrogen receptors, ERα and ERβ,

in    contrast     to   certain    other     estrogens,     notably     medications       that

preferentially act on one of these receptors. These medications are called

selective estrogen receptor modulators, or SERMs.

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PRINCIPLE OF THE ASSAY

The   microtiter   plate   provided   in   this   kit   has   been  pre-coated   with   an

goat-anti-rabbit   antibody.   Standards   or   samples   are   then   added   to   the

appropriate   microtiter   plate   wells   with   a   HRP-conjugated   Estradiol   and

antibody  preparation  specific  for   Estradiol   and  incubated.  Then   a   TMB

（3,3',5,5' tetramethyl-benzidine） substrate solution is added to each well.

The     enzyme-substrate      reaction    is  terminated    by   the  addition    of   a

sulphuric      acid    solution     and     the    color    change      is   measured

spectrophotometrically        at  a   wavelength     of   450   nm    ± 2    nm.   The

concentration      of   Estradiol    in  the   samples    is  then    determined     by

comparing the O.D. of the samples to the standard curve.

DETECTION RANGE

20   pg/ml-1000   pg/ml.   The   standard   curve   concentrations   used   for   the

ELISA’s were 1000 pg/ml, 500 pg/ml, 200 pg/ml, 60 pg/ml, 20 pg/ml.

SPECIFICITY

This    assay    recognizes     recombinant      and   natural    rat  Estradiol.   No

significant cross-reactivity or interference was observed.

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SENSITIVITY

The   minimum   detectable   dose   of   rat   Estradiol   is   typically   less   than   5

pg/ml.

The   sensitivity   of   this   assay,   or   Lower   Limit   of   Detection   （LLD）   was

defined   as   the   lowest   protein   concentration   that   could   be   differentiated

from zero.

MATERIALS PROVIDED

              Reagent                                   Quantity

              Assay plate                               1  （96T）

              Standards （S1-S5）                              5

              HRP-conjugate                               1 x 6ml

              Antibody                                    1 x 6 ml

                                                         1 x 15 ml

              Wash Buffer

                                                      （20×concentrate）

              Substrate A                                 1 x 7ml

              Substrate B                                1 x 7 ml

              Stop Solution                              1 x 7 ml

   Standard      Standard 1    Standard 2    Standard 3   Standard 4    Standard 5

Concentration

                   20pg/ml       60pg/ml      200pg/ml     500pg/ml      1000pg/ml

    （pg/ml）

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STORAGE

1.  Unopened   test   kits   should   be   stored   at   2-8°C   upon   receipt   and   the

    microtiter   plate   should   be   kept   in   a   sealed   bag   with   desiccants   to

    minimize exposure to damp air. The test kit may be used throughout

    the   expiration     date  of   the  kit.  Refer   to  the  package     label   for  the

    expiration date.

2.  Opened   test   kits   will   remain   stable   until   the   expiring   date   shown,

    provided it is stored as prescribed above.

3.  A  microtiter   plate   reader   with   a   bandwidth   of   10 nm  or   less   and   an

    optical   density   range   of   0-3   OD   or   greater   at   450nm  wavelength   is

    acceptable for use in absorbance measurement.

TECHNICAL HINTS

1.  Bring     all  reagents    and   plate  to   room    temperature     for   at  least  30

    minutes     before    use.   Unused     wells   need   store   at  2-8  ℃and      avoid

    sunlight.

2.  Wash   Buffer         If   crystals   have   formed   in   the   concentrate,   warm   to

    room  temperature   and   mix   gently  until   the   crystals  have   compley

    dissolved. Dilute 15 ml of Wash Buffer Concentrate into deionized or

    distilled water to prepare 300 ml of Wash Buffer.

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 3. To avoid cross-contamination, change pipette tips between additions

    of    each   standard     level,  between      sample    additions,    and    between

    reagent additions. Also, use separate reservoirs for each reagent.

 4. When   using   an   automated   plate   washer,   adding   a   30   second   soak

    period following the addition of wash buffer, and/or rotating the plate

    180 degrees between wash steps may improve assay precision.

 5. To   ensure   accurate   results,   proper   adhesion   of   plate   sealers   during

    incubation steps is necessary. Sealers can not be reused.

 6. Substrate   Solution   should   remain   colorless   until   added   to   the   plate.

    Keep     Substrate     Solution    protected    from    light.  Substrate    Solution

    should change from colorless to gradations of blue.

 7. Stop   Solution   should  be   added to   the plate   in   the same   order as   the

    Substrate   Solution.   The   color   developed   in   the   wells   will   turn   from

    blue   to   yellow   upon   addition   of   the   Stop   Solution.  Wells   that   are

    green     in   color   indicate    that   the   Stop   Solution     has  not    mixed

    thoroughly with the Substrate Solution.

Precaution: The Stop Solution provided with this kit is an acid solution. Wear eye,

              hand, face, and clothing protection when using this material.

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OTHER SUPPLIES REQUIRED

  Microplate reader capable of measuring absorbance at 450 nm, with

    the correction wavelength set at 540 nm or 570 nm.

  Pipettes and pipette tips.

  Deionized or distilled water.

  Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate washer.

SAMPLE COLLECTION AND STORAGE

    Serum      Use a serum separator tube （SST） and allow samples to clot

    for   30   minutes   before   centrifugation   for   15   minutes   at   1000   x   g.

    Remove serum and assay immediay or aliquot and store samples at

    -20° C. Avoid repeated freeze-thaw cycles.

    Plasma      Collect    plasma    using   citrate,  EDTA,    or  heparin   as  an

    anticoagulant.     Centrifuge    for  15  minutes   at  1000   x g   within   30

    minutes     of   collection.  Assay    immediay     or   aliquot  and   store

    samples at -20° C. Avoid repeated freeze-thaw cycles.

Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay.

ASSAY PROCEDURE

Bring all reagents and samples to room temperature before use. It is recommended

that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate.

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1.   Set   a   Blank   well  without    any   solution.   Add   50l    of   Standard   or

     Sample per well. Standard need test in duplicate.

2.  Add 50l of HRP-conjugate to each well （not to Blank well）, then

     50l antibody to each well. Mix well and then incubate for 2 hours at

     37°C.

3.   Fill each well with Wash Buffer （about 200l）, stay for 10 seconds

     and    Spinning.    Repeat     the  process    for   a  total  of   three   washes.

     Complete      removal     of   liquid   at  each   step   is  essential    to  good

    performance. After the last wash, remove any remaining Wash Buffer

    by aspirating or decanting. Invert the plate and blot it against clean

    paper towels.

4.  Add 50l of  Substrate   A and  Substrate  B   to   each   well,  mix   well.

     Incubate for 15 minutes at 37°C. Keeping the plate away from drafts

     and other temperature fluctuations in the dark.

5.  Add   50l   of  Stop   Solution  to   each   well.   If   color   change   does   not

     appear uniform, gently tap the plate to ensure thorough mixing.

6.   Determine the optical density of each well within 10 minutes, using a

    microplate reader set to 450 nm.

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CALCULATION OF RESULTS

Average the duplicate readings for each standard, Blank, and sample and

subtract the optical density of Blank. Create a standard curve by reducing

the data using computer software capable of generating a four parameter

logistic （4-PL） curve-fit. As an alternative, construct a standard curve by

plotting the mean absorbance for each standard on the y-axis against the

concentration on the x-axis and draw a best fit curve through the points

on   the   graph.   The   data   may   be   linearized   by   plotting   the   log   of   the

Estradiol concentrations versus the log of the O.D. and the best fit line

can be determined by regression analysis. This procedure will produce an

adequate but less precise fit of the data. If samples have been diluted, the

concentration   read   from   the   standard   curve   must   be  multiplied   by   the

dilution factor.

LIMITATIONS OF THE PROCEDURE

  The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label.

  Do       not  mix   or  substitute   reagents   with   those   from   other   lots  or

     sources.

  It is important that the Calibrator Diluent selected for the standard

     curve be consistent with the samples being assayed.

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  If samples generate values higher than the highest standard, dilute the

     samples with the appropriate Calibrator Diluent and repeat the assay.

  Any         variation    in   Standard      Diluent,     operator,     pipetting     technique,

     washing   technique,   incubation   time   or   temperature,  and   kit   age   can

     cause variation in binding.

  This assay is designed to eliminate interference by soluble receptors,

     binding      proteins,    and    other    factors    present    in   biological     samples.

     Until all factors have been tested in the Quantikine Immunoassay, the

     possibility of interference cannot be excluded.

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                     大鼠大鼠雌二醇雌二醇酶聯免疫酶聯免疫試劑盒試劑盒  

                     大鼠大鼠雌二醇雌二醇酶聯免疫酶聯免疫試劑盒試劑盒  

                              使用說明書使用說明書  

                              使用說明書使用說明書  

本試劑盒僅供研究使用本試劑盒僅供研究使用

本試劑盒僅供研究使用本試劑盒僅供研究使用

產品編號產品編號：CSB-E05110r 

產品編號產品編號

檢測范圍檢測范圍：：20 pg/ml -1000 pg/ml

檢測范圍檢測范圍：：

特異性特異性：：本試劑盒可同時檢測天然或重組的雌二醇，且與其他相關物質基本

特異性特異性：：

無交叉反應。

有效期有效期：6 個月 （2-8℃避光保存）

有效期有效期

預期應用預期應用：：ELISA 法定量測定大鼠血清，血漿及其它相關生物液體中雌二醇

預期應用預期應用：：

含量。

說明說明

說明說明

1.  濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

2.  剛開啟的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗

    結果造成任何影響。

實驗原理實驗原理

實驗原理實驗原理

     采用酶聯免疫競爭法檢測雌二醇含量。首先用羊抗兔包被微孔板，制備成

固相二抗，然后加入待測標本、辣根過氧化物酶標記的雌二醇以及抗雌二醇抗

體，使之形成包被二抗-抗雌二醇抗體-雌二醇 （HRP ）復合物。經顯色后在酶標

儀測定吸光值 （OD 值），通過計算機或作圖擬合濃度-吸光度曲線，反算出待測

標本中雌二醇含量。

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試劑盒組成及試劑配制試劑盒組成及試劑配制

試劑盒組成及試劑配制試劑盒組成及試劑配制

1.  酶聯酶聯板板（Assay plate ）：                                       一塊（96 孔）。

    酶酶聯聯板板

2.  標準品標準品 （Standard）：                                                  5 瓶。

    標準品標準品

  Standard 1       Standard 2      Standard 3       Standard 4     Standard 5

    20pg/ml        60pg/ml         200pg/ml         500pg/ml      1000pg/ml

3.  酶結合物酶結合物 （（HRP-conjugate）：）                                    1×6ml/瓶。

    酶結合物酶結合物 （（               ））

4.  抗體抗體 （（Antibody ）：）                                            1×6ml/瓶。

    抗體抗體 （（         ））

5.  顯色劑顯色劑A  （（Substrate A）：                                       1×7ml/瓶。

    顯色劑顯色劑    （（

6.  顯色劑顯色劑B  （（Substrate B）：                                       1×7ml/瓶。

    顯色劑顯色劑    （（

7.  濃洗滌液濃洗滌液 （（Wash Buffer ）：）    1×15ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋20 倍。

    濃洗滌液濃洗滌液 （（            ））

8.  終止液終止液 （（Stop Solution）：）                                      1×7ml/瓶。

    終止液終止液 （（            ））

需要而未提供的試劑和器材需要而未提供的試劑和器材

需要而未提供的試劑和器材需要而未提供的試劑和器材

1.  標準規(guī)格酶標儀

2.  高速離心機

3.  電熱恒溫培養(yǎng)箱

4.  干凈的試管和Eppendof 管

5.  系列可調節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器

6.  蒸餾水，容量瓶等

標本的采集及保存標本的采集及保存

標本的采集及保存標本的采集及保存

1.  血清：全血標本請于室溫放置2 小時或4℃過夜后于 1000 x g 離心20 分鐘，

    取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

2. 血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑，標本采集后30 分鐘內于2 - 8° C 1000 

    x g 離心 15 分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。 

注：注：以上標本置以上標本置4℃保存應小于℃保存應小于 1 周，周，-20℃或℃或-80℃均應密封保存℃均應密封保存，，-20℃不應超過℃不應超過 1 個月個月，，

注注：：以上標本置以上標本置 ℃℃保存應小于保存應小于  周周，，  ℃℃或或   ℃℃均應密封保存均應密封保存，，  ℃℃不應超過不應超過  個月個月，，

-80℃不應超過℃不應超過2 個月個月；標本溶血會影響zui后檢測結果；標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測，因此溶血標本不宜進行此項檢測。。

   ℃℃不應超過不應超過  個月個月；；標本溶血會影響zui后檢測結果標本溶血會影響zui后檢測結果，，因此溶血標本不宜進行此項檢測因此溶血標本不宜進行此項檢測。。

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操作步驟操作步驟

操作步驟操作步驟

1.  將各種試劑至室溫 〔18-25℃〕平衡半小時，取濃縮洗滌液，根據當批檢測

    數量，用蒸餾水上 1：20 稀釋，混勻后備用。

2.  將酶標板取出，設一個空白對照孔、不加任何液體；每個標準點依次各設兩

    孔，每孔加入相應標準品 50ul；其余每個檢測孔直接加待測標本50ul。

3.  每孔加入酶結合物 50ul            （空白對照孔除外），再按同樣順序每孔加入抗體

    50ul，充分混勻，貼上不干膠封片，置37℃溫育2 小時。

4.  手工洗板，棄去孔內液體。洗滌液注滿各孔，靜置 10 秒甩干，重復三次后

    拍干；洗板機洗板，選擇洗滌三次程序，洗板后拍干。

5.  每孔加顯色劑 A 液 50 μl，顯色劑B 液 50 μl，振蕩混勻后，37℃避光顯色

    15 分鐘，每孔加終止液50 μl。

6.  用酶標儀讀數，取波長450nm，先用空白孔調零點，然后測定各孔OD 值。

數據處理數據處理

數據處理數據處理

1.  手工作圖：用雙對數坐標紙，以標準品濃度為橫軸，以對應的0D 值為縱軸，

    畫出平滑曲線或直線，在曲線上按照待測血清OD 值找到對應的濃度值。

2.  計算機：使用線性擬合功能，應將標準品S1-S5 的濃度取對數 （Log（濃度））

    作為X，將對應的OD 值減去空白對照孔 OD 值后取對數（Log（OD 值-NSB））

    作為Y，進行線性擬合。再從擬合線上計算出待測血清濃度。

注意事項注意事項

注意事項注意事項

1.  從冷藏環(huán)境中取出的試劑盒內全部瓶裝試劑及所需預包被板條應置室溫

 （18-25℃）平衡30 分鐘后方可使用，余者應及時封好口，放回2-8℃中避光保

存，以備后用。

2.  使用前試劑應搖勻。

3.  結果判斷須在反應終止后 10 分鐘內完成。

4.  不同批號的試劑不可混用。

5.  加樣時應注意避免所用各試劑及樣品之間的交又污染。

6.  操作時，試劑盒內每種試劑各使用一個吸頭，每一種標準品使用一個吸頭，

    每一個樣品各使用一個吸頭，吸頭一次性使用。

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Notes ：

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