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大鼠血管緊張素Ⅱ（ANG-Ⅱ）ELISA試劑盒

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     Rat angiotension ⅡⅡ（ANG- ⅡⅡ）

                                                    ⅡⅡ                    ⅡⅡ

                              ELISA Kit

                        Catalog No. CSB-E04494r

                                        （96 T）

    This   immunoassay   kit   allows   for   the   in   vitro   quantitative   determination   of   Rat

    ANG-II concentrations in serum, plasma and other biological fluids.

    Expiration date     six months from the date of manufacture

    FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.

                                           1

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INTRODUCTION

Angiotensin   is   an   oligopeptide   hormone   that   circulates   in   the   blood   and

which   causes   vasoconstriction,   increased   blood   pressure,   and   release   of

aldosterone   from   the   adrenal   cortex.   It   is   also   a   powerful   dipsogen   as   a

result of its actions on the brain. It is derived from the precursor molecule

angiotensinogen,          a  serum     globulin    produced       in  the   liver.  It  plays    an

important   role   in   the   renin-angiotensin   system,   an endocrine   system   that

helps regulate long-term blood pressure and blood volume in the body. The

system can be activated when there is a loss of blood volume or a fall in

blood      pressure.      Angiotensin        I  is   converted       to   angiotensin       II   by

angiotensin-converting           enzyme      （ACE）,     which     is  found    mainly     in  lung

capillaries.     Angiotensin      II  （ANG    II）  plays   an   important     role   in  vascular

disease,   and   angiotensin-converting   enzyme   inhibitors   or   Ang   II   type   1

receptor      antagonists      can    lower    blood     pressure     and    reverse     vascular

remodeling in patients with hypertension or in spontaneously hypertensive

rats.   Ang   II   exerts   some   of   its   effects   on   the   vasculature   by   stimulating

expression        of  growth     factors    including     basic    fibroblast    growth     factor,

plaet-derived growth factor, TGF , IGF-I and the IGF-I receptor （IGF-IR）.

PRINCIPLE OF THE ASSAY

The     microtiter    plate   provided     in  this   kit  has   been    pre-coated       with   an

antibody specific to ANG-II. Standards or samples are then added to the

appropriate        microtiter    plate    wells     with   a    biotin-conjugated        antibody

                                                 2

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preparation      specific  for  ANG-II    and   Avidin   conjugated     to  Horseradish

Peroxidase （HRP） is added to each microplate well and incubated. Then a

TMB   （3,3',5,5'   tetramethyl-benzidine）   substrate   solution   is   added   to   each

well. Only those wells that contain ANG-II, biotin-conjugated antibody and

enzyme-conjugated           Avidin    will   exhibit   a    change      in   color.   The

enzyme-substrate reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid

solution   and   the   color   change   is   measured   spectrophotometrically   at   a

wavelength of 450 nm ± 2 nm. The concentration of ANG-II in the samples

is then determined by comparing the O.D. of the samples to the standard

curve.

DETECTION RANGE

0.45    pg/ml-30    pg/ml.   The   standard     curve   concentrations     used   for  the

ELISA’s were 30 pg/ml，15 pg/ml，7.5 pg/ml，3.75 pg/ml，1.8 pg/ml，0.9

pg/ml，0.45 pg/ml.

SPECIFICITY

This assay recognizes recombinant and natural Rat ANG-II. No significant

cross-reactivity or interference was observed.

SENSITIVITY

The minimum detectable dose of Rat ANG-II is typically less than 0.1 pg/ml.

The sensitivity of this assay, or Lower Limit of Detection （LLD） was defined

as the lowest protein concentration that could be differentiated from zero.

                                             3

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MATERIALS PROVIDED

               Reagent                                         Quantity

               Assay plate                                          1

               Standard                                             2

               Sample Diluent                                  1 x 20 ml

               Biotin-antibody Diluent                         1 x 10 ml

                HRP-avidin Diluent                             1 x 10 ml

               Biotin-antibody                                 1 x 120μl

                HRP-avidin                                     1 x 120μl

                                                               1 x 20 ml

               Wash Buffer

                                                            （25×concentrate）

               TMB Substrate                                   1 x 10 ml

               Stop Solution                                   1 x 10 ml

STORAGE

1.   Unopened   test   kits   should   be   stored   at   2-8°C   upon   receipt   and   the

    microtiter plate should be kept in a sealed bag. The test kit may be used

    throughout      the  expiration    date  of  the   kit,  provided   it  is  stored  as

    prescribed above. Refer to the package label for the expiration date.

2.   Opened test plate should be stored at 2-8°C in the aluminum foil bag

    with desiccants to minimize exposure to damp air. The kits will remain

    stable until the expiring date shown, provided it is stored as prescribed

    above.

3.   A   microtiter   plate   reader   with   a   bandwidth   of   10   nm   or   less   and   an

    optical   density   range   of   0-3   OD   or   greater   at   450nm   wavelength   is

    acceptable for use in absorbance measurement.

                                             4

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REAGENT PREPARATION

Bring all reagents to room temperature before use.

1.   Wash Buffer          If crystals have formed in the concentrate, warm up to

     room   temperature   and   mix   gently   until   the   crystals  have   compley

     dissolved. Dilute 20 ml of Wash Buffer Concentrate  into deionized or

     distilled water to prepare 500 ml of Wash Buffer.

2.   Standard         Centrifuge   the   standard   vial   at   6000-10000rpm   for       30s.

     Reconstitute       the  Standard       with   1.0   ml   of  Sample       Diluent.     This

     reconstitution produces a stock solution of 30 pg/ml. Allow the standard

     to sit for a minimum of 15 minutes with gentle agitation prior to making

     serial dilutions. The undiluted standard serves as the high standard （30

     pg/ml）.   The  Sample   Diluent   serves   as   the   zero   standard   （0   pg/ml）.

     Prepare fresh for each assay. Use within 4 hours and discard after use.

3.   Biotin-antibody          Centrifuge     the   vial  before    opening.     Dilute   to  the

     working        concentration        using     Biotin-antibody           Diluent（1:100）,

     respectively.

4.   HRP-avidin         Centrifuge the vial before opening. Dilute to the working

     concentration using HRP-avidin Diluent（1:100）, respectively.

Precaution: The Stop Solution provided with this kit is an acid solution. Wear

             eye, hand, face, and clothing protection when using this material.

                                                5

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OTHER SUPPLIES REQUIRED

      Microplate   reader   capable   of   measuring   absorbance  at   450   nm,   with

     the correction wavelength set at 540 nm or 570 nm.

      Pipettes and pipette tips.

      Deionized or distilled water.

      Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate washer.

      An incubator which can provide stable incubation conditions up to 37°C

     ±0.5°C.

SAMPLE COLLECTION AND STORAGE

     Serum      Use a serum separator tube （SST） and allow samples to clot

     for 30 minutes before centrifugation for 15 minutes at 1000 g. Remove

     serum and assay immediay or aliquot and store samples at -20°C.

     Centrifuge   the   sample   again   after   thawing   before   the   assay.   Avoid

     repeated freeze-thaw cycles.

     Plasma       Collect     plasma     using   citrate,  EDTA,     or   heparin    as   an

     anticoagulant. Centrifuge for 15 minutes at 1000 g within 30 minutes of

     collection.   Assay   immediay   or   aliquot   and   store  samples   at   -20°C.

     Centrifuge   the   sample   again   after   thawing   before   the   assay.   Avoid

     repeated freeze-thaw cycles.

Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay.

                                              6

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ASSAY PROCEDURE

Bring     all  reagents     and   samples      to  room     temperature     before     use.   It  is

recommended that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate.

All   the   reagents   should   be   added   directly   to   the   liquid   level   in   the   well.   The

pipette should avoid contacting the inner wall of the well.

 1.    Add   100μl   of   Standard,   Blank,   or   Sample   per   well.   Cover   with   the

     adhesive strip. Incubate for 2 hours at 37°C.

 2.   Remove the liquid of each well, don’t wash.

 3.   Add 100μl of Biotin-antibody working solution to each well. Incubate

     for   1   hour   at   37°C.   Biotin-antibody   working           solution    may     appear

     cloudy.   Warm   up   to   room   temperature   and   mix   gently  until   solution

     appears uniform.

 4.   Aspirate each well and wash, repeating the process three times for a

     total of three washes. Wash: Fill each well with Wash Buffer （200μl） and

     let   it  stand for  2  minutes, then   remove   the   liquid  by flicking  the  plate

     over a sink. The remaining drops are removed by patting the plate on a

     paper   towel.   Complete   removal   of   liquid   at   each   step   is   essential   to

     good performance.

 5.   Add   100μl   of  HRP-avidin   working   solution   to   each   well.   Cover   the

     microtiter plate with a new adhesive strip. Incubate for 1 hour at 37°C.

 6.   Repeat the aspiration and wash three times as step 4.

                                                 7

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7.    Add 90μl of TMB Substrate to each well. Incubate for 10-30 minutes at

     37°C.     Keeping     the   plate   away    from    drafts   and   other   temperature

     fluctuations in the dark.

8.    Add    50μl   of  Stop    Solution   to    each    well  when     the   first   four  wells

     containing the highest concentration of standards develop obvious blue

     color. If color change does not appear uniform, gently tap the plate to

     ensure thorough mixing.

9.    Determine the optical density of each well within 30 minutes, using a

     microplate reader set to 450 nm.

CALCULATION OF RESULTS

Using   the   professional   soft   "Curve   Exert   1.3"   to   make   a   standard   curve   is

recommended, which can be downloaded from our web.

Average the duplicate readings for each standard, control, and sample and

subtract the average zero standard optical density. Create a standard curve

by reducing the data using computer software capable of generating a four

parameter logistic （4-PL） curve-fit. As an alternative, construct a standard

curve   by   plotting   the   mean   absorbance   for   each   standard   on   the   y-axis

against the concentration on the x-axis and draw a best fit curve through the

points on the graph. The data may be linearized by plotting the log of the

ANG-II concentrations versus the log of the O.D. and the best fit line can be

determined        by   regression      analysis.    This    procedure      will  produce      an

                                                8

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adequate but less precise fit of the data. If samples have been diluted, the

concentration      read   from    the  standard     curve   must    be multiplied     by  the

dilution factor.

LIMITATIONS OF THE PROCEDURE

      The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label.

      Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.

      It is important that the Standard Diluent selected for the standard curve

     be consistent with the samples being assayed.

      If samples generate values higher than the highest standard, dilute the

     samples with the appropriate Standard Diluent and repeat the assay.

      Any    variation   in   Standard     Diluent,    operator,    pipetting    technique,

     washing   technique,   incubation   time   or   temperature,  and   kit   age   can

     cause variation in binding.

      This assay is designed to eliminate interference by soluble receptors,

     binding proteins, and other factors present in biological samples. Until

     all  factors    have   been    tested    in  the  Quantikine     Immunoassay,        the

     possibility of interference cannot be excluded.

TECHNICAL HINTS

      Centrifuge vials before opening to collect contents.

      When mixing or reconstituting protein solutions, always avoid foaming.

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      To avoid cross-contamination, change pipette tips between additions of

     each standard level, between sample additions, and between reagent

     additions. Also, use separate reservoirs for each reagent.

      When   using   an   automated   plate   washer,   adding   a   30  second   soak

     period   following   the   addition   of   wash   buffer,   and/or   rotating   the   plate

     180 degrees between wash steps may improve assay precision.

      To   ensure   accurate   results,   proper   adhesion   of   plate   sealers   during

     incubation steps is necessary.

      Substrate Solution should remain colorless or light blue until added to

     the    plate.   Keep    Substrate      Solution    protected     from   light.   Substrate

     Solution   should   change   from   colorless   or   light   blue   to   gradations   of

     blue.

      Stop Solution should be added to the plate in the  same order as the

     Substrate Solution. The color developed in the wells will turn from blue

     to   yellow   upon   addition   of   the   Stop   Solution. Wells  that   are   green   in

     color indicate that the Stop Solution has not mixed thoroughly with the

     Substrate Solution.

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            大鼠血管緊張素大鼠血管緊張素ⅡⅡ（ANG-II）酶聯(lián)免疫分析酶聯(lián)免疫分析

            大鼠血管緊張素大鼠血管緊張素ⅡⅡ                     酶聯(lián)免疫分析酶聯(lián)免疫分析

                         試劑盒使用說(shuō)明書(shū)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

                         試劑盒使用說(shuō)明書(shū)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

本試劑盒僅供研究使用本試劑盒僅供研究使用

本試劑盒僅供研究使用本試劑盒僅供研究使用

產(chǎn)品編號(hào)產(chǎn)品編號(hào)：：CSB-E04494r

產(chǎn)品編號(hào)產(chǎn)品編號(hào)：：

檢測(cè)范圍檢測(cè)范圍：：0.45 pg/ml - 30 pg/ml

檢測(cè)范圍檢測(cè)范圍：：

zui低檢測(cè)限zui低檢測(cè)限：：0.1 pg/ml

zui低檢測(cè)限zui低檢測(cè)限：：

特異性特異性：：本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)天然或重組的大鼠ANG-II，且與其他相關(guān)蛋

特異性特異性：：

白無(wú)交叉反應(yīng)。

有效期有效期：：6 個(gè)月

有效期有效期：：

預(yù)期應(yīng)用預(yù)期應(yīng)用：：ELISA  法定量測(cè)定大鼠血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中

預(yù)期應(yīng)用預(yù)期應(yīng)用：：

ANG-II 含量。

說(shuō)明說(shuō)明

說(shuō)明說(shuō)明

1.  試劑盒保存：未開(kāi)封的試劑盒應(yīng)儲(chǔ)存于2-8℃；開(kāi)封后的酶標(biāo)板應(yīng)與干燥

    劑一起儲(chǔ)存于鋁箔袋中置于2-8℃保存。僅在此出儲(chǔ)存條件下，產(chǎn)品在有

    效期內(nèi)可正常使用。

2.  濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。

3.  中、英文說(shuō)明書(shū)可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。

4.  剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)

    驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。

實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理

實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理

     用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗ANG-II 抗體的微孔

中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、*化的抗ANG-II 抗體、HRP 標(biāo)記的親和素，

經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物TMB 顯色。TMB 在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，

并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的ANG-II 呈正相關(guān)。

用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度 （OD 值），計(jì)算樣品濃度。

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試劑盒組成及試劑配制試劑盒組成及試劑配制

試劑盒組成及試劑配制試劑盒組成及試劑配制

1.  酶聯(lián)板酶聯(lián)板（Assay plate ）：                                      一塊（96 孔）。

    酶聯(lián)板酶聯(lián)板

2.  標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：                                          2 瓶（凍干品）。

    標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品

3.  樣品稀釋液樣品稀釋液（Sample Diluent）：                                  1×20ml/瓶。

    樣品稀釋液樣品稀釋液

4.  *標(biāo)記抗體稀釋液*標(biāo)記抗體稀釋液（（Biotin-antibody Diluent）：）             1×10ml/瓶。

    *標(biāo)記抗體稀釋液*標(biāo)記抗體稀釋液（（                            ））

5.  辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液（（HRP-avidin Diluent）） 1×10ml/瓶。

    辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液（（                         ））

6.  *標(biāo)記抗體*標(biāo)記抗體（（Biotin-antibody）：）                 1×120μl/瓶（1：100）。

    *標(biāo)記抗體*標(biāo)記抗體（（                  ））

7.  辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素（（HRP-avidin）：）            1×120μl/瓶（1：100）。

    辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素（（                ））

8.  底物溶液底物溶液（（TMB Substrate）：）                                   1×10ml/瓶。

    底物溶液底物溶液（（                 ））

9.  濃洗滌液濃洗滌液（（Wash Buffer ）） 1×20ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25 倍。

    濃洗滌液濃洗滌液（（               ））

10. 終止液終止液（（Stop Solution）：）                                     1×10ml/瓶。

    終止液終止液（（                ））

需要而未提供的試劑和器材需要而未提供的試劑和器材

需要而未提供的試劑和器材需要而未提供的試劑和器材

1.  標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀

2.  高速離心機(jī)

3.  電熱恒溫培養(yǎng)箱

4.  干凈的試管和Eppendof 管

5.  系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測(cè)樣品較多時(shí)，用多通道移液器

6.  蒸餾水，容量瓶等

標(biāo)本的采集及保存標(biāo)本的采集及保存

標(biāo)本的采集及保存標(biāo)本的采集及保存

1.  血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2 小時(shí)或4℃過(guò)夜后于1000g 離心20 分鐘，

    取上清即可立即檢測(cè)；或進(jìn)行分裝，并將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但

    應(yīng)避免反復(fù)凍融。解凍后的樣品應(yīng)再次離心，然后檢測(cè)。

2.  血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30 分鐘內(nèi)于2   -   8°C

    1000 g 離心15 分鐘，取上清即可立即檢測(cè)；或進(jìn)行分裝，并將標(biāo)本放于

    -20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。解凍后的樣品應(yīng)再次離心，然后

    檢測(cè)。

3.  細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g 離心20 分鐘，取上清即可立即

    檢測(cè)；或進(jìn)行分裝，并將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

    解凍后的樣品應(yīng)再次離心，然后檢測(cè)。

注：注：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。。

注注：：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果，，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。。

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標(biāo)本的稀釋原則標(biāo)本的稀釋原則：：

標(biāo)本的稀釋原則標(biāo)本的稀釋原則：：

首先通過(guò)文獻(xiàn)檢索的方式了解待測(cè)樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。

只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測(cè)的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過(guò)程中，應(yīng)

做好詳細(xì)的記錄。zui后計(jì)算濃度時(shí)，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：：2 瓶，使用前于6000-10000rpm 離心30 秒。每

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：：

瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10 分鐘以上，然后反復(fù)顛倒

/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為30 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋30 pg/ml，

15 pg/ml，7.5 pg/ml，3.75 pg/ml，1.8 pg/ml，0.9 pg/ml，0.45 pg/ml，樣品

稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0   pg/ml，臨用前15 分鐘內(nèi)配制，用完丟棄，下次

檢測(cè)使用新鮮配置的標(biāo)準(zhǔn)品。

如配制15   pg/ml 標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml  （不要少于0.5ml）30   pg/ml 的上述標(biāo)準(zhǔn)

品加入含0.5ml 樣品稀釋液的Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此類(lèi)

推。

*標(biāo)記抗體的稀釋原則*標(biāo)記抗體的稀釋原則：：

*標(biāo)記抗體的稀釋原則*標(biāo)記抗體的稀釋原則：：

打開(kāi)瓶蓋前請(qǐng)離心，收集瓶壁上的溶液。臨用前以*標(biāo)記抗體稀釋液稀

釋?zhuān)♂屒案鶕?jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制 （每孔100μl），實(shí)際

配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl *標(biāo)記抗體加990μl *標(biāo)記抗體

稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。

辣根辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：：

辣根辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：：

打開(kāi)瓶蓋前請(qǐng)離心，收集瓶壁上的溶液。臨用前以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和

素稀釋液稀釋?zhuān)♂屒案鶕?jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔

100μl），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素

加990μl 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用

前一小時(shí)內(nèi)配制。

操作步驟操作步驟

操作步驟操作步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r(shí)，均需混勻，混勻

時(shí)盡量避免起泡。每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過(guò)高時(shí)，用樣品

稀釋液進(jìn)行稀釋?zhuān)允箻悠贩显噭┖械臋z測(cè)范圍。加樣時(shí)，槍頭應(yīng)直接對(duì)

準(zhǔn)液面，切勿沿孔壁加樣。

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4.  加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，

    余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于

    酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，

    37℃反應(yīng)120 分鐘。

    為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

5.  棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加*標(biāo)記抗體工作液 100μl （取1μl

    *標(biāo)記抗體加99μl *標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，

    在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37℃,60 分鐘。

6.  溫育60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2 分鐘，

    200μl/每孔，甩干。

7.  每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液 （同*標(biāo)記抗體工作液）

    100μl，37℃，60 分鐘。

8.  溫育60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2 分鐘，

    200μl/每孔，甩干。

9.  依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色 （（30 分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)

                                               （（

    準(zhǔn)品的前3-4 孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4 孔顯色不明顯，即可終止）。

10. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加

    入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底

    物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。

11. 用酶聯(lián)儀在450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度 （OD 值）。 在加終止液

    后15 分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)備注實(shí)驗(yàn)備注

實(shí)驗(yàn)備注實(shí)驗(yàn)備注

1.  用戶(hù)在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到

    管底。

2.  每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶

    液及終止液。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD 值至零。

3.  為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上

    蓋或覆膜。

4.  未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、*標(biāo)記抗體

    工作液、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)

    勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品、*標(biāo)記抗體工作液、或辣根過(guò)氧化物

    酶標(biāo)記親和素工作液。

5.  建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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洗板方法洗板方法

洗板方法洗板方法

手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上

鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml

注入孔內(nèi)，浸泡1-2 分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。

 自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中。

計(jì)算計(jì)算

計(jì)算計(jì)算

請(qǐng)從我們的下載專(zhuān)業(yè)軟件"Curve Exert 1.3"，并根據(jù)提示制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD 值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)

數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；

再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方

程式，將樣品的OD 值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即

為樣品的實(shí)際濃度。

注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)

注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)

1.  本操作說(shuō)明適用于本操作說(shuō)明適用于48T 試劑盒試劑盒，， 48T 試劑盒中酶聯(lián)板試劑盒中酶聯(lián)板、標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品、*、*

    本操作說(shuō)明適用于本操作說(shuō)明適用于        試劑盒試劑盒，，      試劑盒中酶聯(lián)板試劑盒中酶聯(lián)板、、標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品、、**

    標(biāo)記抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素減半標(biāo)記抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素減半。。

    標(biāo)記抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素減半標(biāo)記抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素減半。。

2.  當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。

3.  洗滌過(guò)程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。

4.  一次加樣時(shí)間控制在5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

5.  請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。

6.  如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋

    倍數(shù)。

7.  在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

8.  底物請(qǐng)避光保存。

9.  不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

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Notes

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